✍ فناوری Illumina از روش های تعیین توالی نسل دوم  (NGS) 

تعیین توالی DNA از مهم ترین دستاوردهای بشر به حساب می آید، که امروزه روش های مختلفی به منظور تعیین توالی نوکلئوتیدها به کار می رود. تاکنون چندین نسل از فناوری تعیین توالی به وجود آمده است که بر اساس ماهیت عملکرد و اطلاعات خروجی طبقه بندی می شوند. بعد از روش سنگر(sanger)  که به عنوان نسل اول فناوری تعیین توالی شناخته می شود، تعیین توالی نسل دوم تحت عنوان(NGS) هم چون Pyrosequencing، Ion Torrent ،SOLiD  ،Illumina با سه پیشرفت عمده مطرح شد ،که از پیشرفت های آن می توان موارد ذیل را بیان نمود:

۱) به منظور آماده سازی قطعات جهت تعیین توالی به جای استفاده ازسیستم کلونینگ باکتریایی از سیستم های خارج سلولی استفاده می شود.

۲) به جای، صدها واکنش، هزاران تا میلیون ها واکنش تعیین توالی به صورت هم زمان انجام می پذیرد.

۳) نتایج خروجی حاصل از واکنش تعیین توالی به صورت مستقیم و بدون نیاز به الکتروفورز شناسایی می شود.

البته روش های تعیین توالی نسل دوم (NGS)  علیرغم پیشرفت های بسیار، محدودیت های قابل توجهی نیز دارند، که از مهم ترین آن ها کوتاه بودن طول توالی خوانده شده و انحراف ناشی از فرآیند تکثیر است که منجر به محدود شدن امکان تعیین توالی کل ژنوم می شود. که  این محدودیت ها توسط روش های تعیین توالی نسل سوم  (TGS)  با نگاهی متفاوت مرتفع می گردد.

روش/پروتکل تعیین توالی Illumina

پس از اولین روش تعیین توالی نسل دوم تحت عنوان Pyrosequencing که در سال ۲۰۰۵ معرفی گردید،شرکت Solexa در سال ۲۰۰۶ دستگاه تعیین توالی خود تحت عنوان Genome Analyzer II را معرفی کرد که سال بعد امتیاز آن توسط شرکت Illumina خریداری شد. در این روش که نوعی تعیین توالی به وسیله سنتز می باشد، ابتدا آغازگرهای الیگو نوکلئوتیدی به صورت متراکم از طریق پیوندهای کوالان از انتهای ‘۵ به قطعات DNA الگو متصل می شوند.

مرحله تکثیر در این روش به صورت bridge_PCR انجام می شود که در این مرحله از هر قطعه حدود یک میلیون نسخه دو رشته ای حاصل می شود که در نواحی کوچک به صورت خوشه های متمرکز قرار می گیرند . تکثیر شدت سیگنال مورد نیاز برای تشخیص در مرحله تعیین توالی را ضمانت می کند. پس از این مرحله، خوشه های واسرشت شده و به صورت تک رشته ای در می آیند که در مرحله بعد به کار می روند. به زبان ساده تر می توان گفت DNA تازه سنتز شده به منظور اتصال به آغازگر مجاور خم شده و به صورت پل در می آید و محصول تکثیر هر قطعه به شکل خوشه ای قرار می گیرد.

در مرحله بعدی که مرحله ی اصلی تعیین توالی است ۴ نوع dNTP که هر یک دارای یک نوع رنگ فلورسنت می باشند توسط DNA پلیمراز به رشته ای که با کمک آنزیم(Linearization enzyme) تک رشته شده است افزوده می شوند. هر نوکلئوتید نشان دار که انتهای ‘۳ آن مسدود است وقتی وارد می شود، واکنش برای مدتی متوقف می شود، نوکلئوتیدهای اضافی از محیط شکسته شده و به دو سمت قطعات، سازگاردهنده افزوده می شود.

سپس این قطعات به آغازگرهای متصل به سطح اسلاید flow_cell متصل می شوند و تکثیر می گردند و سپس flow_cell که سطحی مستحکم می باشد شستشو داده می شود و در این هنگام تصویر توسط دوربین ثبت می گردد و در نهایت مسدودیت انتهای ‘۳ با حذف رنگ فلورسنت برطرف می شود . در واقع می توان گفت مرحله تعیین توالی روندی متوالی و تکرار شونده از ورود نوکلئوتید نشان دار، شستشو، ثبت تصویر، برش نشانه و ایجاد یک ‘۳ آزاد است و در نهایت با آنالیز رنگ های ثبت شده تعیین توالی انجام می شود.

بر خلاف روش سانگر ، در این روش خاتمه زنجیره دائمی نیست و با برش رنگ فلورسنت ادامه واکنش از سر گرفته می شود به همین خاطر به این روش Cyclic reversible termination می گویند.

در روش Illumina طول توالی خوانده شده به ۳۰۰ باز رسیده است و در خوانش توالی نواحی همو پلیمر نسبت به روش Pyrosequencing عملکرد بهتری دارد. ولی هم چنان می توان گفت اصلی ترین محدودیت این روش طول توالی خوانده شده می باشد که به خاطر مزاحمت رنگ فلورسنت در فعالیت آنزیم پلی مراز است که باعث کاهش کارایی این روش در تعیین توالی de novo می شود.

هم اکنون Illumina دستگاه هایی تولید کرده است که علاوه بر آنالیز توالی در آنالیز ترنسکریپتوم و متیلاسیون در سطوح آزمایشگاه های بالینی و تحقیقاتی کاربرد دارند. متداول ترین پلتفرم های آن Miseq ها و Hiseq ها هستند که Miseq ها در آزمایشگاه های تشخیص طبی کاربرد دارند و با سرعت عمل بالا ژنوم های کوچک مثل باکتری ها و بخش های خاص ژنوم را تعیین توالی می کنند. اما Hiseqها در آزمایشگاه های تحقیقاتی کاربرد دارند و قادرند طی چند روز اطلاعاتی در حد Tb فراهم کنند. برای مثال Hiseq X Ten که در سال ۲۰۱۴  معرفی شد قادر است کل ژنوم (WGS) را تعیین توالی کند.

شرکت Illumina ادعا کرده است که با پیشرفت های متنوعی که در سیستم نوری و flow_cells  این نسخه ایجاد کرده است توانسته به هدف گزاری NGHRI که در واقع تعیین توالی هر فرد بود دست پیدا کند و با این دستاورد در مطالعه ژنتیک جمعیت ها تحولی عظیم ایجاد کند و در نهایت مفهوم پزشکی شخصی را به واقعیت نزدیک کرده است.

   تعیین توالی سنگر به روش اتومات

 روش سنگر (sanger) – نسل اول تعیین توالی DNA

توالی یابی به روش پیروسکانس (Pyrosequencing)/پایروسیکوئنسینگ

 تکنیک توالی یابی ماکسام گیلبرت – روش تجزیه شیمیایی یا شکست زنجیر