بررسی ماتریکس متالوپروتئینازها با تکنیک زایموگرافی
زایموگرافی به معنی مشاهده ی چشمی و کشیدن منحنی فعالیت آنزیمی توسط دانسیتومتر است و عمدتا برای بررسی ماتریکس متالوپروتئینازها بکار می رود.
ماتریکس متالوپروتئینازها در فرآیند های فیزیولوژیک مختلفی نقش دارند که از جمله ی آنها می توانیم به فرآیند های تولید مثل، مهاجرت سلولی، مورفوژنز بافت های جنینی، آنژیوژنز و ترمیم زخم اشاره کنیم .این آنزیم ها در فرآیند های پاتولوژیک هم مهم هستند و از عوامل مهم پاتوژنز آترواسکلروز، آنوریسم آئورت، آمفیزم ریوی ، بولوس پمفیگوس، سرطان و متاستاز هستند.
ماتریکس متالوپروتئیناز ها اغلب بصورت پروآنزیم ترشح شده و تحت تاثیر پروتئاز های دیگر فعال می شوند. یکی از معروفترین متالوپروتئینازها، کلاژناز یا MMP1 است. کلاژناز روی کلاژناز نوع یک اثر کرده و آن را به دو قسمت تقسیم می کند که با انجام SDS-PAGE می شود میزان کلاژن تجزیه نشده و محصولات حاصل از تجزیه کلاژن را در مقایسه با مقدار اولیه سوبسترا تعیین کرد و فعالیت آنزیمی آن را محاسبه کرد.
ماتریکس متالوپروتئینازهای دیگه ای مثل ژلاتینازها و استرومیلیزین ها باعث تجزیه وسیعتر سوبسترای خود می شود و در نتیجه محصولات خیلی کوچکتری ایجاد می کنند که با SDS-PAGE قابل بررسی نیستند و برای تعیین فعالیت این آنزیم ها از زایموگرافی استفاده می شود. در حال حاضر این آزمون یکی از آزمایشهای روزمره در آزمایشگاه های تحقیقاتی است و از آن برای مقایسه فعالیت پروتئازی ترشحات سلول های مختلف در بیماری ها، التهاب ها و سرطان استفاده می شود.
زایموگرافی در واقع تکنیکی الکتروفورزی و نوع خاصی از SDS-PAGE است که طی آن ژل پلی اکریلامید با سوبسترای آنزیم مورد نظر کوپلیمریزه می شود و بعد از آن الکتروفورز انجام می شود. پس از اتمام کار ژل در بافر شستشو داده می شود تا SDS از محیط خارج شود و آنزیم فعالیت اولیه ی خودش را کسب کند. بطور کلی روش زایموگرافی، برای بررسی متالوپروتئیناز هایی مثل ژلاتیناز ها، استرومیلیزین ها و فعال کننده های پلاسمینوژن که بعد از دناتوره شدن در اثر (SDS-PAGE) دوباره توانایی کسب شکل طبیعی خودشان را دارند، قابل استفاده است.
در نهایت، ژل در بافر حاوی کاتیون های لازم برای فعالیت متالوپروتئیناز ها انکوبه می شود تا آنزیم که در ناحیه خاصی از ژل تجمع پیدا کرده روی سوبسترا اثر کند. اغلب بعد از رنگ آمیزی و رنگبری ، هاله های شفاف و بی رنگی ظاهر می شوند که نشان دهنده ی فعالیت پروتئولیتیک آنزیم بوده و به روش دانسیتومتری قابل اندازه گیری هستند. در صورتی که از سوبسترای نشان دار شده با ماده رادیواکتیو استفاده شود، می توان ژل را روی فیلم رادیوگرافی قرار داد و بعد از مدتی فیلم را بررسی کرد.
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
مزایا استفاده از روش زایموگرافی:
این روش نسبت به سایر روش های اندازه گیری متالوپروتئینازها مزایای ویژه ای دارند و کاربرد وسیع تری دارند:
۱-با این روش می توان وزن مولکولی تقریبی آنزیم را تعیین کرد و نوع آنزیم را تعیین کرد. در مطالعه ی اولیه ی پروتئازها از سوبستراهای عمومی استفاده می شود، ولی بعد از تعیین نوع آنزیم می شود سوبستراهای اختصاصی تری را به کار گرفت. به عنوان مثال برای بررسی فعال کننده های پلاسمینوژن از کازئین و پلاسمینوژن بطور همزمان استفاده می شود. پلاسمینوژن بعد از فعال شدن و تبدیل شدن به پلاسمین باعث تجزیه ی کازئین می شود.
2-بعد از آن میزان فعالیت پروتئولیتیک پلاسمین روی کازئین سنجیده می شود. برای بررسی الاستازها می شود از کوپلیمریزاسیون آلفا الاستین با ژل پلی اکریلامید استفاده کرد. همچنین با این روش می شود آنزیم هایی مثل هیالورونیدازها را که بخش کربوهیدراتی مولکول های ماتریکس را تخریب می کنند بررسی کرد.
3-در این روش اغلب پرو آنزیم ها تحت تاثیر SDS به صورت آنزیم فعال در می آیند، برای همین فعال سازی اولیه برای تبدیل پروآنزیم ها به آنزیم فعال ضروری نیست. بر خلاف SDS-PAGE معمولی در این روش برای جلوگیری از تخریب آنزیم از جوشاندن نمونه یا بکارگیری مواد احیا کننده خودداری شده و سیستم الکتروفورز به سیستم خنک کننده هم مجهز می شود.
4-در این روش مهار کننده های اختصاصی متالوپروتئیناز ها هم که ساختمان پروتئینی دارند از آن جدا شده و فعالیت آنزیم را مهار نمی کنند.
5-زایموگرافی حساسیت خوبی دارد و ۱۰-۱ میکرولیتر از مایع روی کشت سلولی یا عصاره حاصل از لیز سلولی برای آزمایش کافی است.
بیشتر بخوانید: