✍ تعیین توالی ژنوم میکروارگانیسم ها و توسعه بخش جدیدی از مطالعات DNA تحت عنوان post genomics/functional genomics 

وقتی که توالی یک ژنوم به طور کامل شناسایی شد، مرحله بعد شناسایی جایگاه تمامی ژن ها و نیز تعیین عملکرد هریک از آن ها می باشد. اینجاست که بیوانفورماتیک که گاهی تحت عنوان بیولوژی مولکولی در سیستم درون رایانه ای (in silico) به آن اشاره می شود، به عنوان ابزاری با ارزش در آزمایشات معمول مطرح می شود. تفسیر ژنوم فرایند ساده ای نیست، حتی برای ژنوم هایی که قبل از توالی یابی کامل، به وسیله ی آنالیزهای ژنتیکی و تکنیک های کلونینگ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته اند.

تعیین محل ژن از طریق جستجوی همولوژی

شناسایی ابتدای یک ژن معمولا با جستجوی همولوژی (تشابه) انجام می پذیرد. این آنالیز به وسیله ی کامپیوتر انجام می شود که در آن ژن مورد نظر با تمام توالی های موجود در پایگاه بین المللی داده های DNA نه تنها با ژن های موجود مورد مطالعه، که با همه گونه ها مقایسه می شود. دلیل آن بر اساس این منطق می باشد که دو ژن از دو موجود متفاوت که عمل یکسانی دارند دارای توالی مشابه هستند که تاریخچه تکامل مشترک آن ها را نشان می دهد.

جهت انجام یک جستجوی همولوگ توالی نوکلئوتید یک ژن اولیه به توالی اسیدآمینه ترجمه می شود که این خود اجازه جستجوی دقیق تر را می دهد. آن بدین خاطر است که در مقابل ۲۰ اسیدآمینه مختلف تنها ۴ نوکلئوتید وجود دارند، بنابراین احتمال اینکه دو توالی اسیدآمینه به طور اتفاقی کاملا مشابه باشند بسیار کم است. آنالیز از طریق اینترنت و با ورود به سایت یکی از پایگاه های داده های DNA و استفاده از برنامه جستجو مانند BLAST انجام می گیرد. اگر توالی مورد آزمایش بیش از ۲۰۰ اسیدآمینه داشته باشد و ۴۰% یا بیشتر با یک توالی در پایگاه داده تشابه داشته باشد(مثلا در ۱۰۰ اسیدآمینه ۳۰ اسیدآمینه مشابه داشته باشند) معمولا با احتمال بالا آن ها مشابه بوده و ORF مورد مطالعه به عنوان یک ژن واقعی شناسایی می شود.

تعیین عملکرد یک ژن ناشناخته

جستجوی همولوژی می تواند دو هدف را برآورده کند. علاوه بر بررسی صحت تشخیص ژن مورد بررسی، اگر عملکرد ژن همولوگ را بدانیم می توانیم عملکرد این ژن مورد نظر را نیز تشخیص دهیم. تقریبا دو هزار ژن از ژنوم مخمر با این روش تعیین عملکرد شده اند. با این وجود تعداد زیادی از این ژن هایی که توسط همولوژی جفت شده اند که هنوز عملکرد آن ها مشخص نشده است. این ژن های ناشناخته، ژن های بی سرپرست نامیده می شوند و فهم عملکرد آن ها یکی از اهداف کلیدی تحقیقات پسا ژنومیک است.

استفاده از بیوانفورماتیک ساختاری که تلاش می کند ساختار یک پروتئین را از توالی اسیدآمینه ای آن حدس بزند، می تواند بینشی نسبت به عملکرد ژن های بی سرپرست فراهم نماید. هم اکنون، استفاده از توالی نوکلئوتیدی ژن برای پیش بینی موقعیت مارپیچ های آلفا و صفحات بتا در پروتئین کد شده، اگرچه با صحت پایین، امکان پذیر شده است و گاهی اطلاعات ساختاری بدست آمده می تواند جهت استنتاج عملکرد پروتئین مورد استفاده قرار  گیرد. پروتئین هایی که به غشا متصل می شوند را اغلب می توان مورد شناسایی قرار داد، چون آن ها آرایش های مارپیچ آلفایی دارند که سراسر غشا را طی می کنند. همچنین موتیف های باند شونده به DNA، مثلا انگشت روی (zinc finger) نیز قابل شناسایی هستند. زمانی که اطلاعات لازم در رابطه با ساختار پروتئین و عملکرد آن در دسترس باشد، توجه و صحت این جنبه از بیوانفورماتیک بیشتر خواهد بود. در حال حاضر بررسی عملکرد ژن های بی سرپرست به مقدار زیادی به آزمایشات مرسوم بستگی دارد.

تعیین عملکرد ژن با بررسی تجربی نیازمند یک رویکرد معکوس به علم ژنتیک است!

شناسایی آزمایشی عملکرد ژن ناشناخته یکی از بزرگترین چالش ها در تحقیقات ژنومی می باشد. مشکل اینست که هدف (طراحی مسیری از ژن به سمت عملکرد آن) معکوس کردن مسیر نرمال است که با استفاده از آنالیزهای ژنتیکی صورت می گیرد که در نقطه شروع، فنوتیپ قرار دارد و هدف شناسایی ژن مورد بررسی است. در آنالیز های مرسوم ژنتیک، اساس ژنتیکی یک فنوتیپ معمولا با جستجوی موجودات تغییر یافته ژنتیکی که در آن ها فنوتیپ تغییر یافته است، مورد بررسی قرار می گرفت. این موجودات تغییر یافته ممکن است با روش های آزمایشگاهی به دست آیند، به عنوان مثال با تیمار کردن جمعیتی از موجودات مانند باکتری های کشت داده شده با استفاده از اشعه  uvیا مواد شیمیایی جهش زا می توان ارگانیسم موتانت به دست آورد، یا اینکه این موجودات موتانت ممکن است به طور طبیعی در جمعیت های نرمال وجود داشته باشند. سپس با بررسی های ژنتیکی، ژن هایی که در ارگانیسم موتانت تغییر یافته اند مورد مطالعه قرار می گیرند و می توان موقعیت ژن مورد نظر را در ژنوم مشخص کرد و معین کرد که آیا این ژن همانند ژنی که از قبل ویژگی هایش مشخص است، می باشد. این ژن را سپس می توان با تکنیک های بیولوژی مولکولی از قبیل کلونینگ و توالی یابی تحت مطالعات بیشتری قرار داد.

قاعده کلی این آنالیزهای مرسوم (ژنتیک مستقیم- forward genetics) به این صورت است که ژن مسئول ایجاد یک فنوتیپ را می توان با مشخص کردن اینکه کدام یک از ژن های غیر فعال شده در ارگانیسم باعث بروز فنوتیپ موتانت شده است، مورد شناسایی قرار داد. اگر نقطه شروع مسیر ژنتیکی به جای فنوتیپ، ژن باشد با روشی معادل- ژنتیک معکوس- می توان در ژن مورد نظر موتاسیون ایجاد کرد و توسط آن تغییرات فنوتیپی ایجاد شده را شناسایی کرد. این اساس اکثر روش هایی است که جهت تعیین عملکرد ژن های ناشناخته مورد استفاده قرار می گیرند.

ژن های خاصی را می توان با نوترکیبی همولوگ غیر فعال کرد.

آسان ترین روش برای غیر فعال کردن یک ژن خاص اینست که آن ژن را با یک قطعه DNA غیر مرتبط مختل کرد که این کار را می توان با ایجاد نوترکیبی همولوگ بین نسخه کروموزومی ژن و یک قطعه از DNA ثانویه( که دارای توالی های مشابه با ژن هدف است) انجام داد.

عمل غیر فعال سازی ژن چگونه انجام می شود؟ برای شرح این موضوع دو مثال را در نظر خواهیم گرفت، ابتدا با ساکارومایسس سرویزیه شروع می کنیم. زمانی که توالی یابی ژنوم مخمر در سال ۱۹۹۶ به پایان رسید، زیست شناسان مولکولی مخمر اقدام به تلاش های هماهنگ و بین اللملی جهت تعیین عملکرد بسیاری از ژن های ناشناخته کردند. در این تکنیک از کاست حذفی(Deletion cassette) که دربردارنده ژن مقاومت به آنتی بیوتیک است استفاده می شود. این ژن یک جزء طبیعی از ژنوم مخمر نمی باشد، ولی با انتقال آن به داخل کروموزوم مخمر، فعال خواهد شد و باعث ایجاد توانایی مقاومت به آنتی بیوتیک جنیتیسین (geneticin) در سلول های مخمری ترانسفورم شده می شود.

قبل از استفاده از قاب حذفی، قطعات جدید DNA به صورت دنباله هایی به هر دو انتهای کاست حذفی متصل می شوند. این قطعات با بخش هایی از ژنی که قرار است غیر فعال شود دارای توالی های یکسانی می باشد. بعد از اینکه کاست تغییر یافته وارد سلول مخمر شد، نوترکیبی همولوگ بین دنباله های DNA و نسخه کروموزومی ژن مخمر صورت می گیرد و ژن مقاومت به آنتی بیوتیک جایگزین آن ژن در مخمر می شود که این منجر به غیر فعال شدن ژن هدف می شود. سلول هایی که در آن ها این جابه جایی صورت گرفته است بر روی محیط آگار حاوی جنیتیسین جهت انتخاب کشت داده می شوند و فنوتیپ آن ها به منظور فهم عملکرد ژن، مورد بررسی قرار می گیرد.

 مبحث مطالعه ژنوم

مطالعه ژنوم – پروتئوم(Proteome)

مطالعه ژنوم – ترانسکریپتوم(Transcriptome)