کاربردهای تکنیک FISH در آزمایشگاه های سیتوژنتیک
اساس تکنیک FISH، بیش از ۳۰ سال پیش توسعه پیدا کرد، و کاربردهایی که در بردارنده تشخیص پروب DNA ی هیبرید شده با توالی های هدف کروموزومی، در اواخر ۱۹۸۰ پا به آزمایشگاه های سیتوژنتیک بالینی گذاشت.
FISH که به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی به کار گرفته می شود، در برگیرنده هیبریداسیون یک پروب DNA ی نشاندار شده به یک هدف کروموزومی در جا است.
در سال ۱۹۶۹ تکنیک هیبریداسیون در جای فلورسنت (FISH) توسط Gall and Pardue و همچنینJone و همکاران ابداع گردید.FISH یک تکنیک در سیتوژنتیک پزشکی به شمار می رود و به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی به کار گرفته می شود. با استفاده از تکنیک FISH می توان محل یک ژن و یا بخشی از یک ژن را بر روی کروموزوم تعیین کرد. در تکنیک FISH از پروب های (کاوشگرهای) فلوئورسنت استفاده می شود.
این پروب ها بخشی از مولکول DNA و یا RNA است که مکمل توالی های ویژه ای بر روی کروموزوم ها بوده و به آن ها متصل می شود. وسیله مورد نیاز جهت مطالعه در تکنیک FISH میکروسکوپ فلورسانس می باشد. تکنیک FISH یک روش قدرتمند برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی و سایر جهش های ژنتیکی به حساب می آید.
مزیت اصلی و مهم تکنیک هیبریداسیون در جای فلورسنت (FISH)
فرایند کلی هیبریداسیون، ضرورتا̋ با آن چیزی که در رابطه با پروب های رادیواکتیو استفاده می شد، شباهت داشت، اما مزیت اصلی و مهم این روش (FISH) تشخیص فلورسنت توالی های پروب است که حساسیت بالا در سنجش سریع و ساده را فراهم می نمود. در سال های اخیر سیتوژنتیک مولکولی، قسمت اصلی آزمایشگاه های سیتوژنتیک بالینی را به خود اختصاص داده است.
مطالعه ناهنجاری های ژنتیکی ای که برای مشاهده توسط تکنیک های سیتوژنتیکی معمول،خیلی کوچک و برای تشخیص با استفاده از توالی یابی DNA استاندارد بسیار بزرگ هستند، به وسیله FISH امکان پذیر می باشد. علاوه بر این، پیچیدگی تغییرات تعداد کپی در ژنوم انسان محسوس می باشد، و FISH به ابزاری مهم برای مشاهده تغییرات تعداد نسخه تبدیل شده، که سبب شناسی تغییر را تعیین می کند و هم بستگی اهمیت بالینی را مشخص می کند.
تکنیک FISH (هیبریداسیون در جای فلورسنت):
این تکنیک با استفاده از یک پروب، حضور یک توالی خاص DNA در کروموزوم های موجود بر روی اسلایدهای میکروسکوپی را نشان می دهد. DNA که ممکن است در هسته ی (Nuc ish) سلولهای اینترفازی یا غیرتکثیری و یا درکروموزوم های متافازی (ish) باشد، روی یک اسلاید تثبیت شده و همان جا (in situ) واسرشته می شود. به این ترتیب امکان جفت شدن پروب واسرشته شده نشان دار با DNA کروموزومی میسر می شود. موقعیت علامت هیبریداسیون با میکروسکوپ فلورسنس قابل مشاهده شده و به طور دقیقی محل قطعه DNA هیبرید شده با پروب را تعیین می نماید.
تکنیک FISH دستورالعمل/ روش کار پایه:
روش FISH که به طور گسترده در آزمایشگاه های بالینی به کار گرفته می شود، در برگیرنده هیبریداسیون یک پروب DNA ی نشاندار شده به یک هدف کروموزومی در جا است. با استفاده از گرمخانه گذاری در دمای بالا در یک محلول نمک/فرمامید، پروب و DNA های هدف واسرشته می شوند، پروب درمقادیر اضافی به کار گرفته می شود،تا از اتصال پروب به DNA هدف ویژه، اطمینان حاصل شود.
تشخیص پروب، به وسیله بر انگیختن نور فرابنفش (UV) از یک فلورو کروم از جمله فلورسئین_۵_تیوسیانات (FITC) یا ردامین که مستقیما به DNA پروب متصل شده یا توسط گرمخانه گذاری شده یک پروب نشاندار هاپتن (بیوتین یا دیگوکسی ژین) با یک کانجوگه فلورسنت، انجام می شود.
الگو های سیگنال FISH ممکن است به صورت دستی توسط کارشناس متخصص نمره بندی شود یا امکان دارد که محاسبه خودکار نقطه توسط کامپیوتر، در آنالیز وارد شود.
انواع پروب
با توجه به فراوانی داده های توالی های در دسترس از پروژه ژنوم انسان، پروب های قابل استفاده در روش کار FISH،ممکن است برای مطالعه تقریبا هر جایگاه کروموزومی انسان تولید شوند. با این وجود اکثر پروب های استفاده شده، برای مقاصد بالینی، از نظر تجاری ساخته می شوند و به عنوان واکنش گرهای ویژه آنالیت که باید توسط هر آزمایشگاه تایید اعتبار شوند، فروخته می شوند.
اکثر پروب های FISH در یکی از این سه دسته قرار می گیرند:
- توالی تکراری
- کل کروموزوم
- توالی منحصر به فرد
انواع پروب در تکنیک FISH
- توالی تکراری
- توالی های ماهواره ای آلفا
- توالی های ماهواره ای بتا
- توالی های ماهواره ای کلاسیک
- توالی های تکرار تلومری (TTAGGG)
توالی های ماهواره ای آلفا: بیشترین استفاده از پروب های توالی تکراری در مورد توالی ماهواره ای آلفا است که در سانترومر های کروموزوم های انسان قرار دارند.
- DNAی ماهواره ای آلفا از مونومرهای تکراری پشت سر هم تشکیل شده و به این دلیل توالی های هدف گیری شده توسط پروب ها به تعداد چند صد یا چند هزار نسخه وجود دارند که سیگنال های قدرتمندی را تولید می کنند. هر توالی ماهواره ای آلفای هر کروموزوم (به استثنای کروموزوم های ۱۳و ۲۱و ۱۴ و ۲۲) ، به اندازه کافی واگرا است تا امکان توسعه پروب های مختص سانترومر را فراهم کند.
توالی های ماهواره ای بتا: در بازوهای کوتاه کروموزوم های آکروسانتریک قرار دارند.
توالی های ماهواره ای کلاسیک: در نواحی مختلفی از جمله ناحیه هترو کروماتینی کروموزوم Y وجود دارند.
توالی های تکرار تلومری (TTAGGG) : انتهاهای فیزیکی هر کروموزوم انسانی را علامت گذاری می کنند.
- پروب های سانترومری، برای تشخیص آنیوپلوییدی ها در هر دو نوع سلول اینترفازی و متافازی مفید هستند. علاوه بر این پروب های ماهواره ای آلفا برای تشخیص تریزومی یا مونوزومی اکتسابی در بدخیمی ها نظیر تریزومی ۱۲ در لوکمی لنفوسیتیک مزمن ، یا مونوزومی ۷ یا تریزومی ۸ در اختلالات میلوییدی سودمندند.
پروب های کل کروموزوم:
پروب های کل کروموزوم به عنوان پروب های رنگ کننده ی کروموزوم یا کتابخانه های کروموزوم هم شناخته می شوند و از توالی های تکراری به طور متوسط و منحصر به فردی از یک کروموزوم کامل یا منطقه ی کروموزومی تشکیل شدند.
ایجاد این نوع پروب، نیازمند این است کهDNAی از یک کروموزوم خاص از بقیه ی ژنوم جدا شود و این رخداد ممکن است با استفاده flow sorting ، هیبریدهای سلول سوماتیک حاوی یک کروموزوم منفرد انسانی یا ناحیه ای از یک کروموزوم یا کروموزوم ریز تکه شده و سپس تکثیر توالی های DNAی تکه شده از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) انجام شود.
#WCP ها از نظر تجاری برای هر یک از کروموزوم های انسانی در دسترس هستند و با بیشترین فراوانی، برای مطالعه ناهنجاری های ساختاری استفاده می شوند.
توالی منحصر به فرد:
سومین و بیشترین نوع پروب مصرفی برای توالی DNAی منحصر به فرد این نوع پروب است. این پروب ها از مناطقی از ژنوم که در هر یک از وکتورها ی مختلف نظیر کاسمیدها، کروموزوم های مصنوعی مخمر (YACs) کروموزوم های مصنوعی باکتریایی (BACs) کلون می شوند یا بواسطه PCR با استفاده از پرایمرهای مختص توالی ساخته می شوند.
بعضی پروب ها شامل توالی های تکراری غیر اصلی (تصادفی) و Cot_1 DNA هستند که باید به مخلوط هیبریداسیون اضافه شده تا مانع از اتصالات غیر اختصاصی شده، به طوری که تنها توالی های منحصر بفرد مشاهده بشوند و سایر پروب ها که پروب های تک نسخه نامیده می شوند، بر اساس توالی های ژنومی ای که عاری از توالی های تکراری اند، طراحی و توسعه داده می شوند.
نشاندار کردن و تشخیص
بیشتر پروب هایی که در آزمایشگاه های سیتوژنتیک بالینی استفاده می شوند، مستقیما نشاندار شده و از نظر تجاری در دسترس هستند، با این وجود پروب ها می توانند به صورت غیر مستقیم از طریق الحاق یک هاپتن (نظیر بیوتین یا دیگوکسی ژنین ) به DNA به واسطه ترجمه ی (پُر کردن) شکاف یا PCR نشاندار بشوند.
هاپتن ها به نوکلئوتیدهای پروب متصل شده و توسط یک واکنش ثانویه با استفاده از یک آنتی بادی نشاندار شده ی فلورسنت، تشخیص داده می شوند. متداولترین سیستم غیر مستقیم، بیوتین _استرپتاویدین و دیگوکسی ژنین _ آنتی دیگوکسی ژنین را در بر می گیرند. فلوروکروم ها (نظیر رُدامین، Texas Red یا فلورسئین) ممکن است با استرپتاویدین و آنتی دیگوکسی _ژنین کانجوگه شده و به محض برانگیختن با یک میکروسکوپ فلورسانس، آشکارا بشوند. به طورجایگزین پروب هایی که به صورت مستقیم نشاندار می شوند (با اتصال فلورکروم به نوکلئوتیدهای پروب) به واکنش ثانویه نیاز ندارند و ممکن است مستقیما پس از برانگیختن فلورسنت مشاهده شوند.
انواع تکنیک FISH
- تکنیک FISH متافازی
- تکنیک FISH ساب تلومری (subted)
- تکنیک FISH اینترفازی (هیبریداسیون درجا هسته ای)
- تکنیک FISH متافازی
کاربردهای بالینی مطالعات ساختاری FISH
یک مزیت عمده ی FISH ،توانایی آن در تشخیص و شناسائی ناهنجاری های کروموزومی است، که به طور عادی، با مطالعات نواربندی استاندارد تعیین نمی شوند. این فن آوری امکان تشخیص مضاعف شدگی ها و حذف های ظریف، شناسایی کروموزوم های نشانگر، و شناسایی سایر بازآرایی ها ی کروموزومی را می دهد. علاوه براین، FISH برای مشاهده ی انحرافاتی که توسط آنالیز های ریزآرایه ای تعداد نسخه تشخیص داده می شوند و جهت ارزیابی نمونه های والدینی برای تغییر تعداد نسخه و یا تعیین یک باز آرایی متعادل استفاده می شود.
ریزحذف ها و ریزمضاعف شدگی ها
ریز انحرافات یا سندرم های ژنی مجاور، بواسطه ی حذف یا مضاعف شدن مواد ژنتیکی ایجاد می شوند، که معمولا چند ژن مجاور روی یک کروموزوم را درگیر می کنند. این سندرم های ژنی مجاور که غالبا با دخالت حذف ها و مضاعف شدگی هایی با اندازه ۲ مگاباز یا کمتر صورت می گیرند، بواسطه مطالعات عادی کروموزوم ها قابل شناسایی نیستند، بنابراین، آنالیز FISH، تست تشخیصی قطعی ای برای این ناهنجاری ها فراهم می کند.