رنگ آمیزی اسید فست در باکتری به منظور تشخیص سویه های بیماری زا
تکنیک رنگ آمیزی زیل نلسون یکی دیگر از روش های رنگ آمیزی باکتری هاست که برای اولین بار توسط Dr.Franz Ziehl و Dr.Friedrich Neelsen ابداع شد. واژه اسید فست به معنی مقاوت در مقابل رنگ بری با یک رنگ بر قوی اسیدی است. رنگ آمیزی اسید فست متداول ترین روش رنگ آمیزی در مایکوباکتریولوژی می باشد.
این خاصیت در باکتری های جنس مایکوباکتریوم و نوکاردیا و تک یاخته کریپتوسپوریدیوم وجود دارد بنابراین با استفاده از رنگ آمیزی اسید فست می توان اکتینومیست های جنس نوکاردیا از جمله؛ نوکاردیا استروئیدس و نوکاردیا برازیلنسیس را که به عنوان عوامل نوکاردیوزیس ریوی مطرح هستند، شناسایی کرد. هچنین تک یاخته انگلی کریپتوسپوریدیوم که عامل عفونت گوارشی و اسهال در انسان می باشد، با روش رنگ آمیزی اسید فست شناسایی شده است.
روش رنگ آمیزی اسید فست باکتری ها، حضور مایکوباکتریوم در نمونه های بالینی را بررسی می کند و می توان از طریق آن سویه های مختلف مایکوباکتریوم از جمله مایکوباکتریوم توبرکلروزیس(عامل بیماری سل)، مایکوباکتریوم اولسرانس(عامل اولسر بورولی) و مایکوباکتریوم لپره(عامل جذام) را شناسایی کرد.
ویدیو آموزشی رنگ آمیزی اسید فست به همراه زیرنویس اختصاصی داروینو
مایکوباکتریوم ها باسیل های بدون حرکت و بدون اسپور می باشند که در دیواره سلولی خود علاوه بر پپتید و گلیکان، مقادیر زیادی گلیکولیپید بویژه اسید میکولیک دارند، بطوریکه 60 درصد دیواره سلولی باکتری را اسید میکولیک تشکیل می دهد.
دیواره سلولی این باکتری ها شبیه موم بوده و نسبتا غیر قابل نفوذ است. اسید میکولیک و سایر گلیکولیپید ها نفوذ مواد شیمیایی مورد نیاز برای رشد باکتری را آهسته می کند، همچنین باکتری را در مقابل عوامل شیمیایی باکتری کش و ترکیبات لیزوزومی محافظت می کنند؛ حتی این باکتری ها را در مقابل خشکی مقاوم می سازد. با این وجود باسیل سل توسط پاستوریزاسیون و سترون سازی عادی توسط حرارت به آسانی از بین می رود. مایکوباتریوم ها به شدت هوازی هستند و رشد بسیار آهسته ای دارند. زمان دو برابر شدن باکتری 18 ساعت است.
برای انجام این تست بعد از جمع کردن نمونه مورد نظرتون، برای تغلیظ نمونه از سانتریفیوژ با سرعت 3000g به مدت 15 دقیقه استفاده کرده. با این کار مایکوباکتریوم ها در انتهای لوله جمع شده و پس از خالی کردن محلول رویی، از رسوب حاصل برای کشت و رنگ آمیزی استفاده شده.
باکتری های اسید فست به دلیل داشتن دیواره مومی، تقریبا نفوذ ناپذیر بوده و به سادگی با رنگ های روتین رنگ نمی شوند بنابراین سایر روش های رنگ آمیزی از جمله گرم برای آن ها کاربردی ندارند.
تست توبرکولین
در روند عفونت اولیه، میزبان نسبت به باسیل های سل دچار ازدیاد حساسیت شده و این امر از طریق مثبت شدن تست جلدی یا واکنش توبرکولین مشخص می شود. تست مثبت توبرکولین نشان می دهد که شخص در گذشته به باسیل سل آلوده شده و همچنان مایکوباکتریوم های زنده را در برخی از بافت های خود حمل می کند. این افراد در معرض خطر پیشرفت بیماری از طریق فعال شدن مجدد عفونت اولیه می باشند.
کشت و ایزولاسیون مایکوباکتریوم ها
مایکوباکتریوم ها به شدت هوازی هستند و رشد آهسته ای دارند. زمان دو برابر شدن باکتری(G.T) به طور متوسط 12 ساعت و در مورد باسیل سل 20 تا 22 ساعت می باشد. سریع ترین رشد مایکوباکتریوم ها در مدت 2 تا 3 روز است و مایکوباکتریوم های بیماریزا در طی 2 تا 6 هفته رشد می کنند. در محیط حاوی 5 تا 10 درصد دی اکسید کربن رشد بهتری انتظار می رود.
محیط های مناسب کشت برای مایکوباکتریوم ها:
- Egg Based Media: این محیط حاوی تخم مرغ، پودر سیب زمینی، گلیسرول، املاح و رنگ مالاشیت گرین است. مالاشیت گرین از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری میکند.
- Serum or Agar Based Media: محیط های سرم آلبومین مانند محیط مید لبروگ آگار شامل نمک های مختلف، ویتامین ها، کوفاکتور ها و مالاشیت گرین می باشد که با اسید اولئیک و آلبومین گاوی غنی شده است. این محیط شفاف بوده و می توان با بزرگنماییی کم میکروسکوپ کلونی های اولیه را در محیط کشت شناسایی کرد.
- Liquid Media: در محیط های مایع گونه های مایکوباکتریوم می توانند سریعتر رشد کنند. محیط مید لبروگ براث جهت کشت مجدد سویه ای ذخیره استفاده می شود.
تست های تشخیصی مایکوباکتریوم ها:
برای تشخیص مایکوباکتریوم ها از بین روش های رنگ آمیزی باکتری ها، رنگ آمیزی اسید فست انجام می شود، سپس نمونه را بر روی محیط های جامد، کشت می دهند و خصوصیات فنوتیپی مثل مورفولوژی، کلنی، سرعت رشد، دمای بهینه رشد، واکنش های بیوشیمیایی و پیگمنتاسیون نسبت به نور مورد بررسی قرار میدهند.
خصوصیات کلنی: مایکوباکتریوم ها به دلیل وجود فاکتور طنابی که باعث ایجاد رشته های خمیده باسیل می شود، کلنی خشک وخشن به رنگ سفید شیری تا کرم رنگ ایجاد می کنند
سرعت رشد: بسته به گونه مایکوباکتریوم از 3 تا 60 روز متغیر است.
واکنش در برابر نور:
- فتوکروموژن: گونه هایی هستند که در مجاورت نور رنگدانه های کاروتن تولید می کنند
- اسکوتوکروموژن: گونه هایی هستند که هم در تاریکی و هم در روشنایی رنگدانه تولید می کنند
- غیر کروموژن: گونه هایی هستند که در هیچ شرایطی قادر به تولید رنگدانه نیستند
تست های بیوشیمیایی: این تست ها به علت سرعت آهسته رشد ممکن است چندین هفته به طول بیانجامد همانند تست نیاسین، تست احیا نیترات، تست احیا تلوریت و …
روش کار/پروتکل رنگ آمیزی اسید فست:
رنگ کربول فوشین محلول در چربی است، همچنین دارای فنول می باشد که نفوذ رنگ به داخل دیواره سلولی را تسهیل می کند. این فرایند طی سه مرحله انجام می شود:
مرحله اول: رنگ آمیزی اولیه است که در رنگ کربول فوشین را جهت نفوذ بهتر به دیواره سلولی مومی مایکوباکتریوم حرارت می دهیم که این موضوع سبب اتصال رنگ به اسید مایکولیک دیواره سلولی می شود
مرحله دوم: رنگ زدایی است که در این مرحله با استفاده از محلول ضد رنگ سلول های پس زمینه بافت و هر ارگانیسم دیگر موجود در اسمیر به جز مایکوباکتریوم رنگ زدایی می شوند.
مرحله سوم: رنگ آمیزی با متضاد رنگ اولیه است. با اضافه کردن متیلن بلو، تمام مواد بک گراند آبی رنگ می شود و به واسطه این رنگ متضاد باسیل های اسید فست به رنگ قرمز دیده می شوند.
اسمیر رنگ شده با رنگ بر های بسیار قوی (اسید کلریدریک 3 درصد و اتانول 95 درصد) رنگ زدایی نمی شود و رنگ اولیه را حفظ می کند، در این پروسه جهت رنگ آمیزی باکتری های غیر اسید فاست که رنگ اولیه را از دست دادند، از رنگ متضاد متیلن بلو استفاده می شود. در این تکنیک باکتری های اسید فاست به رنگ قرمز و مواد زمینه و سایر باکتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.
برای یادگیری روش رنگ آمیزی اسید فست و سایر تکنیک های مورد نیاز آزمایشگاه میکروبیولوژی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
چکیده مراحل رنگ آمیزی اسید فست به صورت زیر است:
- تهیه گسترش و فیکس کردن آن
- حرارت دهی به اسمیر تهیه شده و پوشاندن آن با رنگ کربول فوشین تا جایی که بخار کند که این موضوع باعث می شود احتمال نفوذ رنگ به درون باسیل ها افزایش پیدا کند(دقت داشته باشید اسلاید بیش از حد گرم نشود و حالت جوشیدن رخ ندهد). در صورت لزوم رنگ اضافه کنید و ۵ دقیقه نگه دارید.
- پس از سرد شدن اسلاید، شستشوی رنگ کربول فوشین با آب انجام شود تا آب اضافی از روی اسلاید تخلیه شود.
- رنگ زدایی: رنگ زدایی با استفاده از محلول اسید سولفوریک ۲۰ درصد به مدت ۲ الی ۳ دقیقه انجام می گیرد تا اسمیر به رنگ صورتی در بیاید. (در صورت نیاز این مرحله نیز تکرار شود).
- پوشاندن اسمیر با متیلن بلو ۰۱/ % به مدت ۳۰ ثانیه.
- شستشو با آب یا آبکشی کامل اسلایدها و خشک کردن آن ها با حرارت.
- بررسی اسلاید زیر میکروسکوپ نوری با زوم x 100 انجام شود.
نکته مهم و قابل توجه در تهیه محلول های مورد نیاز برای رنگ آمیزی اسید فست این است که باید در شیشه های کدر نگهداری شوند و در مدت زمان کمتر از 4 هفته استفاده شوند زیرا کریستال هایی در محلول کربول فوشین ایجاد می شود که رنگ آمیزی را با مشکل مواجه می کند و نتایج به دست آمده ممکن است اشتباه باشد.
تفسیر نتایج حاصل از رنگ آمیزی اسید فست: در صورتی که مراحل به صورت صحیح و با دقت انجام شده باشد انتظار می رود باکتری های اسید فست به صورت منفرد یا گروه های کوچک و به رنگ قرمز دیده شوند و مواد زمینه ای و سلول های دیگر بخاطر گرفتن رنگ متیلن بلو به خود، به صورت آبی رنگ دیده شوند.
به جز رنگ آمیزی اسید فست، روش دیگر برای مشاهده مایکوباکتریوم ها استفاده از رنگ اورامین و رودامین است، با این روش باکتری ها رنگ فلوئورسنت را جذب کرده و با اسید آن را از دست نمی دهند. در مشاهده باکتری ها، به صورت نقاط نورانی در یک زمینه سیاه دیده می شوند در این روش مدت زمان کمتری برای مطالعه اسلاید صرف شده است.
- بخوانید مقاله جامع رنگ آمیزی باکتری ها | آشنایی با ۴ روش رنگ آمیزی متداول