✍ تکنیک رنگ آمیزی اسید فاست در باکتری به منظور تشخیص گونه های بیماری زا

تکنیک رنک آمیزی اسید فاست، یکی از مهمترین روش های تشخیصی میکوباکتریوم توبرکلوزیس از میکوباکتریوم لپره محسوب می شود.علاوه بر این، با استفاده از رنگ آمیزی اسید فاست می توان اکتینومیست های جنس نوکاردیا از جمله؛ نوکاردیا استروئیدس و نوکاردیا برازیلنسیس را که به عنوان عوامل نوکاردیوزیس ریوی مطرح هستند، شناسایی کرد. هچنین تک یاخته انگلی کریپتوسپوریدیوم که عامل عفونت گوارشی و اسهال در انسان می باشد، با این روش قابل شناسایی است.

مایکوباکتریوم ها باسیل های بدون حرکت و بدون اسپور می باشند که در دیواره سلولی خود علاوه بر پپتید و گلیکان مقادیر زیادی گلیکولیپید بویژه اسید میکولیک دارند، بطوریکه ۶۰ درصد دیواره سلولی باکتری را اسید میکولیک تشکیل میدهد.

دیواره سلولی این باکتری ها شبیه موم بوده و نسبتا غیر قابل نفوذ است. اسید میکولیک و سایر گلیکولیپید ها نفوذ مواد شیمیایی مورد نیاز برای رشد باکتری را آهسته می کند، همچنین باکتری را در مقابل عوامل شیمیایی باکتری کش و ترکیبات لیزوزومی محافظت می کنند. حتی این باکتری ها را در مقابل خشکی مقاوم می سازد. با این وجود باسیل سل توسط پاستوریزاسیون و سترون سازی عادی توسط حرارت به آسانی از بین می رود.مایکوباتریوم ها به شدت هوازی هستند و رشد بسیار آهسته ای دارند. زمان دو برابر شدن باکتری ۱۸ ساعت است.

برای انجام این تست بعد از جمع کردن نمونه مورد نظرتون، برای تغلیظ نمونه از سانتریفیوژ با سرعت ۳۰۰۰g به مدت ۱۵ دقیقه استفاده کرده. با این کار مایکوباکتریوم ها در انتهای لوله جمع شده و پس از خالی کردن محلول رویی، از رسوب حاصل برای کشت و رنگ آمیزی استفاده شده.

 تست توبرکولین

در روند عفونت اولیه، میزبان نسبت به باسیل های سل دچار ازدیاد حساسیت شده و این امر از طریق مثبت شدن تست جلدی یا واکنش توبرکولین مشخص می شود. تست مثبت توبرکولین نشان می دهد که شخص در گذشته به باسیل سل آلوده شده و همچنان مایکوباکتریوم های زنده را در برخی از بافت های خود حمل می کند. این افراد در معرض خطر پیشرفت بیماری از طریق فعال شدن مجدد عفونت اولیه می باشند.

کشت و ایزولاسیون مایکوباکتریوم ها

مایکوباکتریوم ها به شدت هوازی هستند و رشد آهسته ای دارند. زمان دو برابر شدن باکتری(G.T) بطور متوسط ۱۲ ساعت و در مورد باسیل سل ۲۰ تا ۲۲ ساعت می باشد.سریع ترین رشد مایکوباکتریوم ها در مدت ۲ تا ۳ روز رشد کرده و مایکوباکتریوم های بیماریزا در طی ۲ تا ۶ هفته رشد می کنند. در محیط حاوی ۵ تا ۱۰ درصد دی اکسید کربن رشد بهتری دارند.

محیط های مناسب کشت برای مایکوباکتریوم ها 

Egg Based Media: این محیط حاوی تخم مرغ، پودر سیب زمینی، گلیسرول، املاح و رنگ مالاشیت گرین است. مالاشیت گرین از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری میکند.

Serum or Agar Based Media: محیط های سرم آلبومین مانند محیط مید لبروگ آگار شامل نمک های مختلف، ویتامین ها، کوفاکتور ها و مالاشیت گرین می باشد که با اسید اولئیک و آلبومین گاوی غنی شده است. این محیط شفاف بوده و می توان با بزرگنماییی کم میکروسکوپ کلونی های اولیه را در محیط کشت شناسایی کرد.

Liquid Media: در محیط های مایع گونه های مایکوباکتریوم می توانند سریعتر رشد کنند. محیط مید لبروگ براث جهت کشت مجدد سویه ای ذخیره استفاده می شود.

تست های تشخیصی مایکوباکتریوم ها

برای تشخیص مایکوباکتریوم ها ابتدا رنگ آمیزی اسید فاست انجام شده، سپس نمونه را بر روی محیط های جامد، کشت می دهند وخصوصیات فنوتیپی مثل مورفولوژی، کلنی، سرعت رشد، دمای بهینه رشد، واکنش های بیوشیمیایی و پیگمنتاسیون نسبت به نور مورد بررسی قرار میدهند.

خصوصیات کلنی: مایکوباکتریوم ها به دلیل وجود فاکتور طنابی که باعث ایجاد رشته های خمیده باسیل می شود، کلنی خشک وخشن به رنگ سفید شیری تا کرم رنگ ایجاد می کنند

سرعت رشد: بسته به گونه مایکوباکتریوم از ۳ تا ۶۰ روز متغیر است.

 واکنش در برابر نور:

§         ۱.فتوکروموژن: گونه هایی هستند که در مجاورت نور رنگدانه های کاروتن تولید می کنند

§         ۲.اسکوتوکروموژن: گونه هایی هستند که هم در تاریکی و هم در روشنایی رنگدانه تولید می کنند

§         ۳. غیر کروموژن: گونه هایی هستند که در هیچ شرایطی قادر به تولید رنگدانه نیستند

تست های بیوشیمیایی: این تست ها به علت سرعت آهسته رشد ممکن است چندین هفته به طول بیانجامد مثل تست نیاسین، تست احیا نیترات، تست احیا تلوریت و …

رنگ آمیزی اسید فاست

این تکنیک برای اولین بار توسط Dr.Franz Ziehl و Dr.Friedrich Neelsen ابداع شد. واژه اسید فاست به معنی مقاوت در مقابل رنگ بری با یک رنگ بر قوی اسیدی است. این خاصیت در باکتری های جنس مایکوباکتریوم و نوکاردیا و تک یاخته کریپتوسپوریدیوم وجود دارد.

باکتری های اسید فاست به دلیل دیواره مومی تقریبا نفوذ ناپذیر بوده و به سادگی با رنگ های روتین رنگ نمی شوند. رنگ کربول فوشین محلول در چربی است، همچنین دارای فنول می باشدکه نفوذ رنگ به داخل دیواره سلولی را تسهیل می کند.از طرفی این فرایند با کمک حرارت به انجام می رسد.اسمیر رنگ شده با رنگ بر های بسیار قوی (اسید کلریدریک ۳ درصد و اتانول ۹۵ درصد) رنگ زدایی نمی شود و رنگ اولیه را حفظ می کند، در این پروسه جهت رنگ آمیزی باکتری های غیر اسید فاست که رنگ اولیه را از دست دادند، از رنگ متضاد متیلن بلو استفاده می شود. در این تکنیک باکتری های اسید فاست به رنگ قرمز و مواد زمینه و سایر باکتری ها به رنگ آبی مشاهده می شوند.

روش دیگر برای مشاهده مایکوباکتریوم ها استفاده از رنگ اورامین و رودامین است، با این روش باکتری ها رنگ فلوئورسنت را جذب کرده و با اسید آن را از دست نمی دهند. در مشاهده باکتری ها، به صورت نقاط نورانی در یک زمینه سیاه دیده می شوند در این روش مدت زمان کمتری برای مطالعه اسلاید صرف شده. 

تکنیک رنگ آمیزی گرم

تکنیک رنگ آمیزی اسید فاست در باکتری

دستورالعمل رنگ آمیزی اسپور باکتری

تکنیک رنگ آمیزی کپسول و رنگ آمیزی باکتری گرم منفی