✍ توالی یابی سنگر، تکنیکی به منظور تعیین ترتیب دقیق بازها در نوکلئیک ‌اسیدها

ایجاد کتابخانه‌های DNA، پایه تکنیک‌های توالی یابی ژنوم بود و انجام آن را ممکن ساخت. فردریک سنگر (Frederick Sanger) که یک زیست شیمیدان انگلیسی بود در سال ۱۹۷۴ تکنیکی را جهت تعیین توالی ژن‌ها در محیط in vitro  ابداع کرد که تاکنون بیشتر از همه مورد استفاده قرار گرفته است، این تکینک توالی یابی Sanger نام گرفت که به روش خاتمه زنجیره سازی یا روش دی داکسی نیز معروف است و اساس آن آنزیمی می‌باشد. توالی یابی Sanger زیربنای همه تکنولوژي‌های توالی یابی است که هم اکنون مورد استفاده قرار می‌گیرند و ژنومیکس (علم مطالعه ژنوم‌) را شکل داده است. جهت تعیین توالی ژنوم‌های فراوانی مانند E. coli، مگس سرکه، کرم‌های نواری (نماتودها)، موش و انسان از تکنیک توالی یابی sanger استفاده شده است.

توالی یابی Sanger مثل فرایند تکثیر DNA و تکنیک PCR به پرایمر، DNA پلیمراز، توالی الگوی تک‌رشته‌ای و دئوکسی نوکلئوتیدها نیاز دارد. در ابتدا سوبسترای واکنش عمدتا DNA نوترکیبی بود که به وسیله دناتوراسیون می توانست به پرایمر توالی‌‌یابی اختصاصی رشته متصل شود. قطعات DNA در وکتورهای فاژمیدی هم چون وکتور M13 که در اثر دستکاری می‌توانستند DNAهای نوترکیب تک‌رشته‌ای تولید کنند، نیز کلون می‌شدند.

روش جایگزینی که امروزه نیز کاربرد فراوانی دارد ایجاد DNA تک رشته ای  از طریق تعیین توالی چرخه(Cycle sequencing) یا تعیین توالی تکثیر خطی است که در این حالت روند کار شبیه PCR است ولی فقط از یک پرایمر استفاده می شود که همین امر سبب می شود که محصول PCR به صورت خطی (و نه تصاعدی) افزایش یابد و پلیمراز مورد استفاده هم نباید دارای خاصیت proofreading باشد تا سرعت الحاق نوکلئوتیدها افزایش پیدا کند. در تکنیک توالی یابی Sanger، درصد معینی از نوکلئوتیدها که فاقد ۳-هیدروکسیل هستند و دی دئوکسی نوکلئوتید (Dideoxynucleotide: ddNTP)  نامیده می‌شوند که با دئوکسی نوکلئوتیدهای نرمال مخلوط می‌شوند. آنزیم‌های پلیمراز نمی توانند دئوکسی نوکلئوتیدها را از دی دئوکسی نوکلئوتیدها افتراق دهند. DNA پلیمراز افزودن نوکلئوتید بعدی را با اتصال فسفات روی کربن ۵ آن، به  ۳-هیدروکسیل نوکلئوتید پیشین و با تشکیل پیوند فسفودی‌استر انجام می‌دهد پس صورتی که یکی از نوکلئوتیدها فاقد ۳-هیدروکسیل باشد، نوکلئوتید دیگری اضافه نخواهد شد و زنجیره به طور ناگهانی خاتمه می یابد. نسبت دئوکسی ریبونوکلئوتیدها بسیار بالاتر از  دی دئوکسی ریبونوکلئوتیدهاست، به همین دلیل خاتمه سنتز زنجیره جدید در نزدیکی پرایمر اتفاق نمی افتد. این امکان  وجود دارد که پلیمریزاسیون چند صد نوکلئوتید، پیش از آن که باز خاتمه دهنده رشته اضافه شود رخ دهد. در چنین واکنش‌هایی عمدتا حداکثر طول قطعات ۸۰۰ نوکلئوتید خواهد بود. چهار واکنش جداگانه برای ddTTP، ddGTP، ddCTP، ddATP انجام می شود ( در هر واکنش یکی از نوکلئوتیدهای طبیعی از نوع نشاندار رادیواکتیو استفاده می شود).

در تکنیک توالی یابی Sanger مولکول‌های DNA تک‌رشته‌ای که فقط در حد یک نوکلئوتید با هم تفاوت دارند، می‌توانند توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید حاوی اوره به عنوان ترکیب دناتوره کننده و یا سایر ترکیبات دناتوره کننده که باعث می شود DNA به صورت تک رشته ای باقی بماند با ولتاژ بالا از یکدیگر جدا شوند.

از اتورادیوگرافی جهت رؤیت نتیجه استفاده می کنند. خواندن اتورادیوگرام از سمت پایین ژل به بالا صورت می گیرد و در این حالت توالی های به دست آمده مکمل توالی اصلی می باشند. داده‌ها نیز به صورت دستی وارد کامپیوتر می‌شوند. به همین دلیل این پروسه بسیار طولانی است، ۱۲ ساعت برای الکتروفورز، ۱۲ ساعت برای ایجاد اتورادیوگرام و مدت زمان بسیار طولانی‌تری برای خواندن توالی‌ها موردنیاز است هم چنین احتمال وقوع اشتباه نیز بالا و استفاده از بازهای لیبل شده با مواد رادیواکتیو خطرناک است به همین دلیل از تعیین توالی سنگر به روش اتومات استفاده می شود که کارآیی آن را افزایش می دهد. در این روش توالی های تا ۴۰۰ نوکلئوتید را می توان تعیین کرد.

تعیین توالی سنگر به روش اتومات

 تکنیک توالی یابی ماکسام گیلبرت – روش تجزیه شیمیایی یا شکست زنجیر

توالی یابی به روش پیروسکانس (Pyrosequencing)/پایروسیکوئنسینگ

تکنولوژی تعیین توالی ایلومینا (Illumina)