✍ آشنایی با اپی ژنتیک و روش های تشخیص متیلاسیون DNA

از تغییرات مهم اپی ژنتیکی می توان متیلاسیون DNA را نام برد  که در سلول های یوکاریوتی اتفاق می افتد، که نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن و محافظت از یکپارچگی DNA  دارد. در حین متیلاسیون یک گروه متیل توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNMT) ،بعد از همانندسازی به کربن شماره ۵ حلقه پریمیدین سیتوزین اضافه می شود و در نهایت ۵- متیل سیتوزین تولید می شود. متیلاسیون فقط در بازهای سیتوزینی که در سمت ‘۵ گوانوزین قرار دارند و به آن ها دی نوکلئوتیدهای CpG گفته می شود اتفاق می افتد ولی  متیلاسیون از جفت شدن باز ها جلوگیری نمی کند زیرا گروه متیل خارج از مارپیچ دو رشته ای است.

اگر در پروموتر متیلاسیون رخ دهد، باعث تغییر در اتصال فاکتورهای رونویسی و سایر پروتئین ها به DNA می شود و در نهایت پروتئین های methyl CpG binding (MeCpG) و هیستون داستیلازها وارد عمل می شوند و باعث فشرده شدن کروماتین در اطراف محل شروع رونویسی ژن می شوند.

در ژنوم انسان فقط نواحی بسیار کوچکی که جزایر CpG نام دارند و در نواحی پروموتری بسیاری از ژن ها یافت می شوند، دارای دی نوکلئوتیدهای CpG هستند که این موضوع به دلیل از بین رفتن آن ها طی تکامل است که به تمایل متیل سیتوزین ها به طور خود به خودی به تیمین ها مربوط است. این جزایر در ناحیه پروموتر چه در شرایط فعال چه غیر فعال بسیار در برابر متیلاسیون محافظت شده اند، ولی گاهی دچار متیلاسیون می شوند و این موضوع باعث خاموشی ژن می شود که مثال آن را دو کروموزوم های X غیر فعال می توان دید.

متیلاسیون سیتوزین ها در DNA ژنومی نقش به سزایی در تنظیم بیان ژن ها دارد و در مطالعات سرطان نیز بسیار حائز اهمیت است که سه مکانیزم مرتبط آن سرطان خاموش کردن ژن های سرکوب کننده تومور در هایپر متیلاسیون نواحی پروموتر، هایپومتیلاسیون پروتوانکوژن ها که باعث عدم توانایی مهار آن ها و در نهایت هایپومتیلاسیون کل ژنوم (نئوپلازی) که باعث افزایش نرخ جهش و ناپایداری کروموزوم می شود، می باشد.

روش های تشخیص متیلاسیون DNA:

تشخیص متیلاسیون در کل ژنوم از طریق تکنیک های جداسازی با کارایی بالا و روش های آنزیمی و مکانیکی انجام می گیرد که دسته دوم اینکه نسبت به دسته اول حساسیت کمتری دارند ولی مقرون به صرفه ترند لذا همواره مورد استفاده قرار می گیرند. تا مدت ها بررسی متیلاسیون ها از طریق اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون و هیبریداسیون ساترن انجام می گرفت. اساس این روش ها عدم توانایی آنزیم های محدودکننده حساس به متیلاسیون در بریدن سیتوزین های متیله شده در جایگاه تشخیص است. DNA ژنومی به وسیله اندونوکلئازهای حساس به برش بریده و در ژل آگارز به پروب های اختصاصی متصل می شود در حالی که در توالی های بریده شده برشی صورت نمی گیرد در نتیجه در الکتروفورز نوارهایی با طول بیشتر دیده می شود.

این تکنیک ها اگر چه مقرون به صرفه اند ولی مشکلات اساسی نیز دارند

فقط سیتوزین هایی قابل بررسی می باشند که به وسیله اندونوکلئازهای اختصاصی متیلاسیون موجود، قابل تشخیص باشند.

این روش ها بیشتر برای آنالیزهای متیلاسیونی کل ژنوم مناسب می باشد ولی در بررسی وضعیت متیلاسیون جایگاه های CpG اختصاصی خیلی مفید نیستند.

این تکنیک ها اگر چه ساده و سریع و دارای حساسیت بالایی هستند ولی به مقدار زیادی DNA با کیفیت نیاز دارند که باید با روش PCR این مشکل را رفع کرد، اما در صورت بهره گیری از PCR تجزیه مولکول های DNA با اندونوکلئازهای حساس به متیلاسیون باید قبل از تکثیر به وسیله PCR صورت گیرد، به دلیل این که متیلاسیون سیتوزین نباید بعد از PCR حفظ شود و ۵ – متیل سیتوزین به سیتوزین تبدیل شود. پرایمرها هم باید به گونه ای طراحی شوند که، اختصاصی نواحی بالادست و پایین دست جایگاه تشخیص اندونوکلئاز حساس به متیلاسیون باشند. سپس DNA شکسته شده تحت تاثیر آنزیم، توسط پرایمرها تکثیر می‌شود. در صورت متیله بودن جایگاه تشخیص، DNA الگو بریده نمی شود و محصول PCR خواهیم داشت. در حالی که اگر جایگاه تشخیص غیرمتیله باشد، از آن‌جایی که توالی الگو به قطعاتی تقسیم می‌شود، محصولی ایجاد نخواهد شد. حتی اگر DNA الگو در جایگاه تشخیص خود کاملا غیرمتیله باشد، به علت حساسیت بالای PCR، وجود نقص در برش در مقادیر اندک نیز می‌تواند منجر به نتایج مثبت کاذب شود. پس تفسیر نتایج این تکنیک باید با احتیاط زیاد انجام گیرد.

بررسی متیلاسیون در بافت به طور اختصاصی از طریق روش های وابسته به هیبریداسیون in situ و با بهره گیری از آنتی بادی های آنتی-متیل سیتوزین لیبل شده صورت می گیرد. از تکنیک های به روز دیگر microarray های اختصاصی متیلاسیون می باشد که به وسیله آن می توان بررسی متیلاسیون چند ژن مختلف در یک آزمایش را بررسی کرد.

روش های بررسی متیلاسیون DNA با استفاده از PCR اختصاصی متیلاسیون (MSP)