✍ مشکلات احتمالی در HRM و روشهای حل خطاهای آزمایش(Troubleshooting)

۱- انتخاب اشتباه موقعیت بین ناحیه ی قبل و بعد از ذوب شدگی

هنگامی که انتخاب محدوده ی قبل و بعد از ذوب شدگی به درستی صورت نگیرد و شامل ناحیه ی ذوب شدگی داده های نرمال شده باشد، گراف های تمایز دارای کیفیت پایینی خواهد بود.

قرار دادن ناحیه پیش و بعد از ذوب شدگی در ناحیه ذوب شدگی باعث می شود تفاوت بین دو هموزیگوت کوچک تر شده و تمایز آن ها سخت تر شود در واقع باعث کاهش وضوح تفکیک بین ژنوتیپ ها می شود. برای حل این مشکل موقعیت قبل و بعد از ذوب شدگی را به گونه ای تعیین کنید که شامل ناحیه ذوب شدگی نشود. اگر رنج شروع و پایان دمای پروتکل HRM در بین ناحیه ذوب شدگی قرار گرفته بود، پروتکل HRM را تکرار کنید ( بدون تکرار مرحله تکثیر) . به عنوان مثال، اگر ناحیه ذوب شدگی از دمای ۷۴ درجه سانتی گراد شروع شود و در دمای ۸۰ درجه پایان پذیرد و شما پروتکل دمایی HRM رااز دمای ۷۵ درجه شروع کرده باشید ، نتایج مطلوبی به دست نخواهید آورد. استفاده از یک طیف گسترده ی مناسب برای وضوح بهتر ناحیه پیش و بعد از ذوب شدگی لازم است.

۲- تشکیل محصولات غیر اختصاصی

محصولات تولید شده غیر اختصاصی در طول PCR، که تا حد زیادی به کیفیت نتیجه ی نهایی بستگی دارد، ممکن است باعث تغییر رفتار ذوب شدگی قطعه ی هدف شود. بنابر این مهم است که در زمان آنالیز HRM قطعه ی غیر اختصاصی در مخلوط واکنش وجود نداشته باشد.

* تکنیک هایی که برای کاهش محصولات غیر اختصاصی استفاده می شود،شامل:

۱.افزایش دمای اتصال و تکثیر

۲.کاهش غلظت پرایمر

۳.بهينه سازی MgCl2

۴.استفاده از پروتکل سه پله ای کاهش زمان اتصال و اضافه کردن مرحله ی طویل سازی در ۷۲ درجه سانتی گراد هنگامی که در حال اسکن ژنی یا مطالعات شناخت گونه ی یک قطعه ی ۲۰۰ تا ۵۰۰ جفت بازی هستید.

۳-تنظیم زمان اتصال و طویل سازی

به دست آوردن محصول با طول کامل در طول تکثیر می تواند به اطمینان بخشی از رفتار ذوب شدگی مناسب در طول آنالیز HRM منجر شود. هنگامی که زمان اتصال و طویل سازی خیلی کوتاه باشد، احتمال تشکیل شدن قطعه های ناقص ( ناشی از DNA پلی مراز که به آخر قطعه نرسیده است) می تواند به طور مؤثر بر روی آنالیز HRM تأثیر منفی بگذارد.

تکنیک آنالیز منحنی ذوب DNA با وضوح بالا (HRM)

بررسی داده های به دست آمده از منحنی ذوب با وضوح بالا (HRM)

مشکلات رایج در منحنی ذوب با دمای بالا (HRM)  و اصلاح روش

رنگ ها و دستگاه های مورد استفاده در HRM