در مطلب گذشته در رابطه با تکنیک آنالیز منحنی ذوب با وضوح بالا (HRM)  و کاربردهای آن توضیحاتی داده شد و گفته شد که رنگ های استفاده شده در HRM با رنگ های معمولی برای RealTime PCR استاندارد فرق دارند. بنابراین در این مطلب به معرفی رنگ های مورد استفاده تکنیک HRM می پردازیم.

سه کلاس اصلی رنگ برای HRM استفاده می شود، شامل:

رنگ های غیراشباع کننده سایبرگرینI: معمول ترین رنگ غیراشباع  درج شونده بین DNA دو رشته ای است که به طور کلی برای کاربرد های HRM نامناسب است. در غلظت های بالا از سایبرگرین DNA I، دو رشته ای را تثبیت می کند و باعث مهار DNA پلی مراز می شود، بنابر این غلظت کمی از سایبرگرین I استفاده می شود . در غلظت کم سایبرگرین I در زمان ذوب ناحیه ی هدف در زمانی که رشته باز و آزاد می شود، می تواند دوباره به قسمت دو رشته روی همان الگو متصل شود، در نتیجه تشخیص اختلاف باز ها ضعیف می شود. برای چیره شدن بر این محدودیت رنگ های اشباع کننده ساخته شدند. در زمان استفاده از رنگ های سایبرگرین به علت نوسانات زیاد در میزان فلورسانس آزاد و افت شده، نمودارهای بر روی گراف نرمال شده، به صورت شکسته و موج دار دیده می شود.

رنگ های اشباع کننده: یک کلاس جدید از رنگ های درج شونده در DNA دورشته ای هستند که مانع عملکرد DNA پلی مراز یا تغییر Tm محصول نمی شوند. این رنگ ها می توانند با غلظت بالاتر نسبت به رنگ های غیراشباع کننده با قطعه ی هدف میان کنش بدهند. رنگ های اشباع کننده قادر به انتشار دوباره زمانی که رشته از هم باز شد نیستند، زیرا DNA دو رشته ای از رنگ اشباع شده است. در نتیجه توانایی دقیق تر رفتار ذوب شدگی DNA را امکان پذیر می سازد. رنگ هایی مثل SYT09 و LC Green در غلظت های اشباع می توانند برای HRM استفاده شوند.

رنگ های انتشار در موقعیت: یک کلاس دیگر از رنگ های درج شونده در DNA دو رشته ای هستند مثل اواگرین، که می توانند در غلظت های غیر اشباع اضافه شوند. این رنگ ها دارای روش جدیدی از نحوه یا انتشار فلورسنس هستند، به طوری که سیگنال فلورسنس زمانی که رنگ در محلول آزاد است، خاموش است ( عامل خاموش کننده به گزارشگر نزدیک می باشد). پس از اتصال به DNA دو رشته ای، رنگ باز شده و عامل خاموش کننده از گزارشگر جدا می شود و رنگ سیگنال فلورسنت بالایی را منتشر می کند. این رنگ ها اجازه ی استفاده در غلظت های غیر اشباع کنندگی از رنگ بدون این که مهار کننده ی PCR باشند را می دهند. مواد شیمیایی منحصر به فرد موجود در این نوع رنگ ها باعث یک آنالیز HRM با حساسیت بالا می شود.

قدرت آنالیز HRM بستگی به حساسیت دستگاه و ماهیت مخلوط واکنش PCR مورد استفاده دارد. به طور کلی دو کلاس مجزا از دستگاه های با توانایی HRM وجود دارد:

 

1.دستگاه های بلوکی: نمونه ها در یک بلوک قرار داده می شوند و اسکن حرارتی یا دوربین ثابتی برای تشخیص استفاده می شود.

  1. دستگاه های روتوری: نمونه ها در یک محفظه قرار داده می شوند و با چرخش در مقابل آشکار ساز نوری قرار می گیرند.

 

هر کدام از این مدل دستگاه ها دارای مزایا و معایبی هستند، که انتخاب بر عهده ی محقق می باشد، اما به عنوان یک قانون کلی برای حساسیت بالا و تکرار پذیری بیشتر استفاده از دستگاه های روتوری بیشتر توصیه می شود و برای استفاده با تعداد نمونه ی بالا و سهولت کار دستگاه های بلوکی بهینه تر هستند. هر دستگاهی باید هر 6 ماه کالیبره شوند و در یک مکان تمیز و ثابت قرار گرفته باشد و از آلودگی و گرد و غبار به دور باشد. مدت انجام یک HRM بین دستگاه های مختلف متفاوت است، به طوری که بعضی دستگاه ها مدت زمان بیشتری را برای انجام HRM لازم دارند. آنالیز داده ها باید با یک نرم افزار مناسب انجام گیرد. نرم افزارهای مخصوص HRM از الگوریتم های مختلفی برای آنالیز داده ها استفاده می کنند و برای تمایز بهتر اختلاف میان واریانت ها، نتایج را به صورت فرمت های ساده ای نشان می دهند.

 

 

تکنیک آنالیز منحنی ذوب DNA با وضوح بالا (HRM)

بررسی داده های به دست آمده از منحنی ذوب با وضوح بالا (HRM)

مشکلات رایج در منحنی ذوب با دمای بالا (HRM)  و اصلاح روش

رنگ ها و دستگاه های مورد استفاده در HRM