کاربردهای تست کواگولاز و DNase پروتکل انجام آزمایش
تست کواگولاز در آزمایشگاه های تشخیص طبی کاربرد دارد و با استفاده از آن می توان استافیلوکوک های بیماری زا(مثبت) را از سویه های غیر بیماری زا (منفی) افتراق داد. آنزیم کواگولاز با مکانیسمی شبیه مکانیسم اصلی لخته شدن، پلاسمای خون را لخته می کند.
هرچند حضور این آنزیم برای بیماری زایی ضروری نیست، ولی شاخص خوبی برای شناسایی باکتری های بالقوه پاتوژن استافیلوکوک اورئوس می باشد. باکتری های تولید کننده کواگولاز رشته های فیبرینی در اطراف خود تنیده و از سیستم ایمنی میزبان فرارمی کنند. در عفونت های استافیلوکوکی ایجاد لخته فیبرینی باعث محدود شدن یا موضعی شدن عفونت می شود.
آنزیم کواگولاز به دو شکل متصل و آزاد وجود دارد:
متصل (Bound Coagulase) به دیواره سلولی باکتری متصل است. برای بررسی فعالیت آنزیم متصل، آزمون لامی(Silde test) بکار می رود. فعالیت کواگولاز متصل با آنتی بادی تولید شده بر علیه کواگولاز آزاد مهار نمی شود.
آزاد (Free Coagulase) ترکیبی شبیه ترومبین است که توسط باکتری تولید و در محیط آزاد می شود. کواگولاز آزاد به واسطه فاکتور فعال کننده، در پلاسما به آنزیمی کارآمد تبدیل شده و با روشی مشابه ترومبین، لخته فیبرین ایجاد می کند.
استافیلوکوک های کواگولاز مثبت با استفاده از این آنزیم پلاسما را لخته می کند. در تست کواگولاز پلاسمای مورد استفاده بوسیله سیترات یا EDTA از نظر لخته شدن غیر فعال می شود تا تداخلی در آزمایش ایجاد نکند.
علاوه بر آنزیم کواگولاز، اکثر گونه های بیماری زای استافیلوکوک آنزیم DNase تولید می کنند. این آنزیم با تجزیه DNA سلول های میزبان ویرولانس باکتری را افزایش می دهد. برای نشان دادن حضور DNase، باکتری را در محیط حاوی DNA کشت می دهند.
وجود هاله شفاف در اطراف کلونی باکتری بیانگر مثبت شدن تست DNase است. این هاله در نتیجه تجزیه مولکول های درشت DNA توسط آنزیم DNase و حل شدن محصول نهایی در اسید اضافه شده به محیط به وجود می آید. DNA تجزیه نشده در اسید ضعیف حل نمی شود، بلکه به وسیله آن رسوب می کند، بنابراین محیط اطراف کلونی که از نظر DNase منفی است، کدر دیده می شود.
دستورالعمل/روش انجام تست کواگولاز
برای انجام تست کواگولاز به پلاسما تازه انسان یا خرگوش نیاز است. بهتر است برای انجام تست کواگولاز از پلاسمای سیتراته استفاده نشود، زیرا باکتری هایی که توانایی مصرف سیترات را دارند در اثر اکسیداسیون آن، کلسیم متصل به سیترات را آزاد می کنند و کلسیم در مسیر انعقاد طبیعی خون باعث تشکیل لخته فیبرینی می شود. بنابراین در نتیجه آزمایش تداخل ایجاد شده و مثبت کاذب بدست می آید.
دستورالعمل/روش انجام تست کواگولاز اسلایدی یا لامی
1. یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی روی لام قرار دهید و با یک لوپ نمونه میکروبی مخلوط کنید تا سوسپانسیون یکنواختی بدست آید.
2. یک قطره پلاسمای رقیق شده(رقت 0.2) به سوسپانسیون میکروبی اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید.
3. با حرکت آرام لام در دست، رسوبات دانه دانه یا لخته سفید رنگ را جستجو کنید. واکنش مثبت معمولا در مدت 15 تا 20 ثانیه با ظهور رسوب دانه دانه یا تشکیل لخته ای سفید رنگ مشخص می گردد. اگر پس از 2 تا 3 دقیقه هیچگونه لخته ای مشاهده نشد، این آزمون منفی تلقی می گردد.
دستورالعمل/روش انجام تست کواگولاز لوله ای
1. در شرایط استریل 0.5 میلی لیتر پلاسمای رقیق شده را در لوله آزمایش کوچک استریل بریزید
2. سپس 0.5 میلی لیتراز کشت میکروبی 18 تا 24 ساعته را به آن اضافه کنید
3. لوله را تکان دهید تا سوسپانسیون کاملا یکنواختی بدست آید
4. لوله را به مدت 1 تا 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه قرار دهید
5. واکنش مثبت با ظهور لخته در انتهای لوله آزمایش مشخص می گردد. اگر لوله را وارونه کنید، لخته همچنان در ته لوله باقی خواهد ماند
برای یادگیری تست کوآگولاز و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه میکروبیولوژی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
روش انجام تست DNase
1. محیط کشت DNase Agar را از پشت پلیت با ماژیک به دو بخش مساوی تقسیم کنید و مشخصات باکتری های مورد آزمایش را در هر قسمت بنویسید
2. نمونه استافیلوکوک اورئوس (کواگولاز مثبت) و استافیلوکوک اپیدرمیس (کواگولاز منفی) را بصورت یک خط مستقیم در دو قسمت پلیت کشت دهید
3. پلیت را به مدت 18 تا 24 ساعت در دمای 35 درجه نگهداری کنید
4. بوسیله پیپت پاستور سطح DNase Agar را با اسید کلریدریک 1 نرمال بپوشانید
5. وجود هاله روشن در اطراف کلنی بیانگر مثبت بودن تست است
تصویر زیر نشان دهنده آزمایش DNase است.
جمع بندی و نکات مهم در حین انجام آزمایش/تست کواگولاز
1. تست کواگولاز لامی به عنوان آزمون فرضی به شمار می رود و در صورتی که جواب منفی یا مثبت تاخیری داشت باید حتما با آزمون لوله ای تایید شود. زیرا بعضی از سویه های استافیلوکوک اورئوس کواگولاز آزاد تولید می کنند که در آزمون لامی شناسایی نمی شود.
2. توصیه می شود لوله تست کواگولاز در فواصل زمانی 30 دقیقه حداکثر تا 4 ساعت مورد بررسی قرار گیرد و اگر پس از این مدت لخته مشاهده نشد نتیجه آزمون منفی گزارش می شود. برخی از سویه های استافیلوکوک اورئوس حدود 18 تا 24 ساعت پس از کشت، آنزیم فیبرینولیزین تولید می کنند که باعث باز شدن لخته فیبرینی می شود، بنابراین اگر لوله آزمایش کواگولاز در 4 ساعت اول مورد بررسی قرار نگیرد ممکن است جواب منفی کاذب ایجاد نماید.
3. در تست کواگولاز لوله ای پس از تلقیح باکتری به پلاسمای سیتراته از مخلوط کردن آن بوسیله ورتکس یا شیکر خودداری کنید.
4. در صورت مثبت بودن تست DNase هاله شفاف اطراف کلنی باید به سرعت قابل مشاهده باشد.
بیشتر بخوانید:
