کاربردهای تکنیک کروماتوگرافی
کروماتوگرافی در اصطلاح به يک سری تکنیک های جداسازی گفته می شود که در آن ها مولکول ها میان دو فاز (فاز ثابت و متحرک) از یکدیگر جدا می شوند. مولکول هایی که تمایل به فاز ثابت دارند، نسبت به مولکول های متمایل به حرکت، با سرعت کمتری حرکت می کنند. فاز ثابت در کروماتوگرافی بستر خلل و فرج داری است که درون ستون قرار گرفته و فاز متحرک محلول شستشو است که از بالای ستون به درون آن پمپ می شود. براساس این که فاز متحرک به صورت مایع یا گاز باشد به دو دسته ی کروماتوگرافی های مایع و گازی تقسیم بندی می شود .
کروماتوگرافی تعویض یون (IEC)
کروماتوگرافی تعویض یون (IEC)
این روش براساس تفاوت بار سطحی در پروتئین ها، آن ها را از یکدیگر جدا می کند. تخلیص بر پایه یک میانکنش برگشت پذیر بین یک پروتئین باردار و یک بستر یا لیگاند با بار مخالف (برهمکنش های یونی) است. در این روش پروتئین هایی که خالص می شوند رقیق نشده.
تعویض کننده های یونی بسترهایی هستند که در آنها گروه های اسیدی و یا قلیایی متعددی وجود دارد. تعویض کننده های یونی قلیایی شامل گروه های با بار مثبت اند که تعویض کننده آنیونی نامیده می شوند. تعویض کننده های کاتیونی حامل گروه های با بار منفی اند که گروه های با بار مثبت را جذب می کنند .
بار سطحی پروتئین ها به pH محیط بستگی دارد. زمانیکه pH بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین (pl) است، پروتئین هدف بار منفی دارد و قادر به اتصال به یک لیگاند با بار مثبت (تعویض کننده آنیونی با بار مثبت) می باشد. زمانیکه pH پائین تر از نقطه ایزوالکتریک باشد پروتئین هدف بار مثبت پیدا می کند و قادر به اتصال به یک تعویض کننده کاتیونی با بار منفی خواهد بود.
کروماتوگرافی تعویض کاتیونی و آنیونی
هرچه pH محلول فاصله بیشتری از pl پروتئین داشته باشد اتصال پروتئین به بستر محکم تر صورت می گیرد. چون اتصالات الکتروستاتیک در قدرت یونی پائین انجام می شوند، برای همین اولین مرحله (یعنی اتصال) در این روش در قدرت های یونی پائین صورت خواهد گرفت، سپس شرایط تغییر کرده و ترکیبات متصل شده با افزایش قدرت يونی- افزایش غلظت نمک یا تغییر pH– که بصورت گرادیان یا مرحله به مرحله اعمال می شود از ستون شسته و جدا می شوند.
در این روش معمولا پروتئین هدف به ستون متصل می شود امادر صورت لزوم می توان ناخالصی ها را هم به ستون متصل کرد و پروتئین هدف را در همان مرحله اول جداسازی کرد. شایان ذکر است که این روش معمولاً جزء روش های میانی در پروسه تخلیص پروتئین می باشد.