روش های تشخیص هویت سلول ها در آزمایشگاه های سلولی
یکی از مهمترین اهدافی که ما بخاطر آن سلول ها را کشت و بعد از آن پاساژ می دهیم، خالص سازی یک تیره ی سلولی مشخص است. این مسئله آنقدر مهم است که اگر یک تیره ی دیگر بین سلول های ما رشد کنند، ما رشد آن ها را یک نوع آلودگی به نام cross contamination به حساب می آوریم. برای اینکه متوجه و مطمئن شویم که سلول ها همگی از همان تیره ی مورد نظر هستند، لازم است که هویت سلول ها را بررسی کنیم.
هر آزمایشگاه بسته به نوع امکاناتی که دارد یکی از این روش ها را انتخاب می کند و البته این تکنیک ها، روش های عمومی برای تشخیص همه ی تیره های سلولی هستند و برای انجام پروژه های خاص تر طبیعتا لازم است که از تکنیک های اختصاصی تر هم استفاده کرد.
تکنیک های مختلفی برای شناسایی و تشخیص هویت سلول ها در آزمایشگاه های کشت سلول وجود دارد، همانند بررسی های ایزوآنزیمی، سیتوژنتیکی؛ بررسی آنتی ژن های سطحی سلول ها و…
تعیین و تشخیص هویت سلول ها بسیار مهم است و می شود گفت روش محک زدن موفق بودنمان در انجام کشت و پاساژ سلول و همین طور به درستی به مقصد رساندن پروژه است. با توجه به اهمیت موضوع در این مقاله قصد داریم به بررسی روش های مختلف شناسایی و تشخیص هویت سلول ها بپردازیم.
در ابتدا با تکنیک های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها آشنا می شویم، سپس در خصوص هر روش توضیحاتی ارائه خواهیم داد.
- بررسی کروموزوم ها (کاریوتایپ)
- استفاده از ماتریژل
- روش های ایمونولوژیک
- روش انگشت نگاری DNA
- بررسی ایزوآنزیم ها
- استفاده از شاخص های آنتی ژنتیکی
- تکنیک ایمونوفلورسانس
- تکنیک فلوسایتومتری
- تکنیک زایموگرافی
- اندازه گیری پروتئاز
- بررسی فعالیت اختصاصی آنزیم ها
تشخیص هویت سلول ها با بررسی کروموزوم ها:
همانطور که می دانید کاریوتایپ گونه های مختلف موجودات کاملا باهم دیگر متفاوت است و از این تفاوت می شود برای تعیین هویت تیره های سلولی استفاده کرد. برای بررسی کروموزوم ها باید سلول ها در مرحله ی متافاز میتوز متوقف شوند.
دستورالعمل/ روش کار تکنیک بررسی کروموزوم ها (کاریوتایپ)
1-ابتدا به ازای هرسانتی متر مربع فلاسک حدود ۵ تا ۱۰ هزارتا سلول کشت می دهیم.
2- مدت ۳ تا ۵ روز بعد از کشت، یعنی درست زمانی که سلول ها در فاز رشد لگاریتمی شان هستند، به آنها کلشی سین یا کلسماید(با غلظت یک ده میلیونیوم مولار) اضافه می کنیم.
این ماده از تشکیل دوک تقسیم جلوگیری می کند باعث توقف سلولها در مرحله ی متافاز می شود. بعد از ۴ تا ۶ ساعت محیط رویی سلول ها را دور می ریزیم و سلول ها را به کمک تریپسین ۰/۲۵ درصد از فلاسک جدا می کنیم و شستشو می دهیم. دوباره مایع رویی را دور می ریزیم و به رسوب سلولی ۵ میلی لیتر محلول هیپوتونیک حاوی ۰/۰۴ مولار کلرید پتاسیم و ۰/۰۲۵ مولار سیترات سدیم می ریزیم و برای ۲۰ دقیقه آن را انکوبه می کنیم تا غشاء سلول ها پاره شوند و کروموزوم ها آزاد شود.
3-حالا نوبت این است که به این سوسپانسیون ۵ میلی لیتر محلول اسید الکل سرد (حاوی یک حجم اسید استیک گلاسیال و سه حجم متانول) اضافه کنیم. این کار برای فیکس کروموزوم ها انجام می شود. لوله را برای ۲ دقیقه سانتریفوژ می کنیم. مایع رویی را دور می ریزیم و دوباره به رسوب باقی مانده محلول اسید الکل اضافه می کنیم و بعد از مخلوط کردنش، برای ۱۰ دقیقه روی یخ قرار می دهیم. لوله را دوباره برای ۲ دقیقه سانتریفوژ می کنیم و مایع رویی را دور می ریزیم و از رسوبش لام تهیه و خشک می کنیم.
نکته مهم این است که باید حواسمان باشد کروموزوم ها بصورت یکنواخت روی لام پخش شوند و روی هم نیوفتند. پس اگر نمونه غلیظ بود آن را رقیق می کنیم و دوباره از آن لام تهیه می کنیم. برای بررسی تعداد کروموزوم ها کافی ست لام ها با گیمسا رنگ آمیزی شوند با محلول مانت و لامل بپوشانیم و با میکروسکوپ نوری بررسی کنیم.
اگر بخواهیم نمونه بیشتر مطالعه و بررسی کنیم می توانیم از تکنیک های ایجاد باند روی کروموزوم ها استفاده کنیم.
برای ایجاد باند با گیمسا (G-Banding)، باید کروموزوم ها را درمعرض تریپسین قرار دهیم تا بعضی از پروتئین های آن تجزیه شود. این طور بعد از رنگ آمیزی با گیمسا کروموزوم ها حالت باند باند به خودشان می گیرند که تعداد این باند ها قابل شمارش است و وجه تشخیصی دارد.
در این روش با تغییر سیستم آزمایش می شود مهارکننده های اختصاصی متالوپروتئینازها را هم اندازه گیری کرد. برای این کار، طبق پروتکل زایموگرافی عمل می کنیم و در مرحله ی نهایی پس از جدا شدن SDS از ژل به جای بافر زایموگرافی از بافری که غنی از پروتئازهای خاص باشد، استفاده می شود.
به عنوان مثال برای بررسی TIMP1 و TIMP2 ژل را در محیط کشت رویی فیبروبلاست که به آن ۴-آمینوفنیل مرکوریک اسید جهت فعال کردن متالوپروتئینازها اضافه شده، انکوبه می کنیم و پس از ۱-۸ ساعت ژل را رنگ آمیزی و سپس رنگ بری می کنیم. پروتئین های موجود در قسمتهایی از ژل که فاقد مهارکننده باشند توسط پروتئاز های مایع رویی کشت تجزیه می شوند، بنابراین این مناطق پس از رنگ آمیزی ژل شفاف خواهند بود ولی سوبستراهای پروتئینی موجود در بخش هایی از ژل که حاوی مهارکننده های اختصاصی پروتئاز هاست، تجزیه نشده و پس از رنگ آمیزی بصورت آبی رنگ دیده می شوند.
علاوه بر این، با روش زایموگرافی، می توان تاثیر مهارکننده های مختلف دارویی را روی فعالیت آنزیم تعیین کرد و عوامل مهارکننده این پروتئاز ها را مشخص کرد. یعنی بعد از اتمام الکتروفورز به بافر انکوباسیون مقدار مشخصی از ماده ی مهار کننده اضافه کرد و میزان کاهش فعالیت پروتئازی را در مقایسه با فعالیت اولیه آنزیم سنجید.
برای این کار، یک نمونه در چند خط الکتروفورز شده و بعد این خطوط بریده شده و هرکدام با مهارکننده ی خاصی مورد بررسی قرار می گیرد. از این خصوصیت زایموگرافی جهت تعیین نوع آنزیم نیز می توان استفاده کرد. علاوه بر این از این روش برای بررسی مهارکننده های اختصاصی فعال کننده های پلاسمینوژن (PAI-2و PAI-1) نیز استفاده می شود.
تشخیص هویت سلول ها با استفاده از ماتریژل
استفاده از ماتریژل (ژل تهیه شده از پروتئین های ماتریکس خارج سلولی) روش دیگری برای بررسی فعالیت ماتریکس متالوپروتئینازها است. این ژل را به دو روش مختلف به کار می برند. در یک روش از ماتریکس نشان دار شده با ماده ی رادیو اکتیو استفاده می شود. در این روش سوسپانسیون سلولی را روی ماتریژل اضافه می کنند و میزان آزاد مواد رادیو اکتیو را در مایع رویی محیط کشت اندازه گیری می کنند.
در روش دیگر سلول ها را بر روی ماتریژل کشت می دهند و بعد از مدت معینی ژل را از نظر میزان نفوذ سلول ها، با میکروسکوپ بررسی می کنند. سلول هایی که متالوپروتئینازهای غشایی داشته باشند، می توانند به دنبال تجزیه ی پروتئین های ماتریکس در ژل نفوذ کنند. بقیه ی سلول ها به طور عادی روی ژل رشد می کنند و داخل ژل وارد نمی شوند.
با این روش قدرت تهاجم سلول های سرطانی را می توان بررسی کرد و حضور متالوپروتئینازهای غشایی را نشان داد. این آزمون حتی ممکن است در آینده برای تعیین قدرت متاستاز سلول های سرطانی به کار گرفته شود.
تشخیص هویت سلول ها با استفاده از روش های ایمونولوژیک
یکی از ساده ترین روش های بررسی متالوپروتئیناز ها سنجش مقدار آن ها با استفاده از روش های ایمونولوژیک است. این روز ها علیه اکثر آنزیم های فوق آنتی بادی مونوکلونال تهیه شده است . حتی علیه مهارکننده های اختصاصی متالوپروتئینازها ، پروآنزیم ها و مجموعه های متالوپروتئیناز متصل به مهار کننده هم آنتی بادی اختصاصی تهیه شده است.
به کمک این آنتی بادی ها تست هایی مثل الایزا، رادیو ایمونواسی و وسترن بلات را می توان طراحی کرد و به راحتی مقدار هر کدام از پروتئاز ها یا مهارکننده های آنها را بصورت کمی تعیین کرد. امروزه با روش های ایمونو هیستوشیمی محل حضور متالوپروتئیناز خاصی را در بافت یا رده سلولی خاص نشان می دهد و به کمک روش های پیشرفته ی بیولوژی مولکولی و ایمونوژنتیک مثل نورثرن بلات و RT-PCR کمی، میزان بیان هر کدام از آنزیم های فوق را می توان تعیین کرد.
تشخیص هویت سلول ها با روش انگشت نگاری DNA
انگشت نگاری DNA از چندین لوکوس ژنی و تعیین پروفایل DNA به وسیله ی PCR مولتی پلیکس از جمله آزمون هایی هستند که در بانک های سلولی انجام می شوند. به کمک انگشت نگاری DNA می شود تیره های سلولی مختلف جداشده از یک گونه ی حیوانی را از همدیگر متمایز کرد . از این تکنیک بیشتر برای اثبات یکسان بودن ویال های کاری بانک سلولی با سلول های مرجع یا اصلی بانک سلولی و تشخیص آلودگی های متقاطع سلولی استفاده می شود.
بیشتر بخوانید:
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
تشخیص هویت سلول ها با بررسی ایزوآنزیم ها
ایزوآنزیم ها گروهی از آنزیم ها هستند که در گونه های مختلف جانداران وجود دارند. آنها خصوصیات آنزیمی مشابهی دارند اما از نظر ساختمانی یا ژنتیک با هم اختلاف دارند. حرکت الکتروفورزی این ایزوآنزیم ها به ترکیب اسیدآمینه های زیرواحد های خود بستگی دارد. مثلا لاکتات دهیدروژناز، ۵ شکل ایزوآنزیمی مختلف دارد که هرکدام از آنها توسط سلول های بافت خاصی تولید می شوند و با اعداد یک تا پنج نام گذاری می شوند.
سلول های گونه های مختلف جانداران دارای ترکیب متفاوتی از این ایزوآنزیم ها هستند. بنابراین با مطالعه ی ایزوآنزیمی تیره های سلولی می شود منشاء بافتی و حتی گونه ی حیوانی سلول را تعیین کرد. این تکنیک همچنین برای شناسایی آلودگی های متقاطع تیره های سلولی با همدیگر کاربرد دارد. مشخصا می دانیم آلودگی متقاطع تا چه حد در کشت و پاساژ سلول هایتان مهم است و چقدر می تواند در کارتان تاثیرگذار باشد.
در این بین بررسی ایزوآنزیم های استراز، پورین نوکلئوزید فسفوریلاز، گلوکز شش فسفات دهیدروژناز و لاکتات دهیدروژناز اهمیت زیادی دارند.
با توجه به الگوی فعالیت و ترشح ایزوآنزیم های مختلف آنزیم هایی که ذکر کردیم، در سلول های مختلف، جدول های مرجعی تهیه شده که به کمک این جدول ها، می توان سلول های گونه های مختلف جانداران را از هم متمایز کرد.
برای انجام چنین آزمایشی باید تعداد مناسبی سلول توسط بافر هیپوتونیک یا با روش فریز و روش دفریز کردن لیز شده و لیزات سلولی الکتروفورز شده و بر روی آن سوبسترای اختصاصی آنزیم اضافه شود تا با توجه به محل قرار گیری باندهای بدست آمده ، نوع ایزوآنزیم و میزان فعالیت آن مشخص شود.
تشخیص هویت سلول ها با استفاده از شاخص های آنتی ژنتیکی
خیلی از سلول ها دارای شاخص های سطحی اختصاصی هستند. مثلا CD34 یکی از شاخص های اختصاصی واقع در سطح سلول های بنیادی خون است. از سال ۱۹۵۷ با معرفی تکنیک تولید آنتی بادی های مونوکلونال، شناسایی اختصاصی چنین شاخص هایی در سطح سلول ها خیلی آسان شده است.
به کمک آنتی بادی هایی که علیه شاخص های سطحی سلول ها تولید شدند، علاوه بر شناسایی انواع سلول ها می شود آنها را از هم تفکیک کرد. این آنتی بادی ها بطور اختصاصی به آنتی ژن های هدف متصل می شوند بنابراین می شود بطور غیر مستقیم مولکول های نشانگر، مثل آنزیم ها یا مواد فلورسنت متصل به خود را به هدف موردنظر وصل کنند. با ردیابی ماده نشانگر می توان از اتصال یا عدم اتصال آنتی بادی به هدف مطلع شد.
تشخیص هویت سلول ها با تکنیک ایمونوفلورسانس
تکنیک ایمونوفلورسانس یکی از تکنیک هایی است که کاربرد زیادی در شناسایی مولکول های سطحی سلول ها دارد. در این تکنیک مولکول نشانگر مواد فلورسنت مثل فلورسئین ایزوتیوسیانات یا رودامین و… هستند که به طور شیمیایی به آنتی بادی موردنظر متصل شدند . آنتی بادی های اختصاصی گران قیمت هستند برای همین در این آزمون ها برای صرفه جویی در مصرف آنتی بادی ها از لام های مخصوص که دارای حفره های کاذب کوچک هستند استفاده می شود.
در صورتی که امکان دسترسی به این لام ها وجود نداشته باشد ، می توان با استفاده از ماژیک های ضد آب حفره ی کاذبی روی لام ایجاد کرد و سوسپانسیون سلولی با رقت مناسب را روی آن اضافه کرد. این سلول ها باید بطور یکنواخت روی لام پخش شوند و سلول ها روی هم نیوفتند. لام ها بعد از خشک شدن، با متانول یا هر فیکساتور مناسب دیگری ثابت شده و آماده ی رنگ آمیزی می شوند.
بیشتر بخوانید:
تشخیص هویت سلول ها با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری
تکنیک فلوسایتومتری شبیه آزمون های ایمونوفلورسانس است با این تفاوت که سلول ها به صورت سوسپانسیون بوده و آنتی بادی های مورد نظر به سوسپانسیون سلولی اضافه می شوند. برای ردیابی هم به جای میکروسکوپ از دستگاه فلوسایتومتر استفاده می شود که از نظر مکانیسم اولیه شبیه به میکروسکوپ ایمونوفلورسنت است.
بعضی از دستگاه های فلوسایتومتری مجهز به سیستم جداسازی سلول ها هم هستند و به ما اجازه می دهند که بتوانیم سلول هایی را که دارای شاخص سطحی موردنظر ما هستند، جداکنیم. به عنوان مثال با کمک این دستگاه ها می توان سلول های بنیادی خون را که دارای شاخص CD34 هستند از خون جدا کنیم.
در صورتی که به عنوان مولکول ردیاب از آنزیم ها استفاده شود، بعد از تمام شدن آزمایش می شود لام ها را با میکروسکوپ معمولی هم بررسی کرد. در این روش که به نوعی تکنیک ایمونوهیستوشیمی است، آنتی بادی ثانویه با یکی از آنزیم های پراکسیداز، تربچه ی کوهی یا فسفاتاز قلیایی تهیه شده از روده گوسفند کونژوگه می شود و روی سلول هایی که قبلا در مجاورت آنتی بادی اولیه قرار گرفتن اضافه می شود.
پس مراحل تکنیک تا اینجا شبیه روش ایمونوفلورسنس غیرمستقیم است. در مرحله ی بعد سوبسترای اختصاصی آنزیم اضافه می شود و بعد از اتمام زمان انکوباسیون واکنش توسط اسید متوقف شده و لام ها بعد از شستشو با میکروسکوپ معمولی بررسی می شوند.
بیشتر بخوانید:
تشخیص هویت سلول ها با استفاده از روش زایموگرافی
زایموگرافی به معنی مشاهده ی چشمی و کشیدن منحنی فعالیت آنزیمی توسط دانسیتومتر است و عمدتا برای بررسی ماتریکس متالوپروتئیناز ها بکار می رود.
ماتریکس متالوپروتئینازها در فرآیند های فیزیولوژیک مختلفی نقش دارند که از جمله ی آنها می توانیم به فرآیند های تولید مثل، مهاجرت سلولی، مورفوژنز بافت های جنینی، آنژیوژنز و ترمیم زخم اشاره کنیم .این آنزیم ها در فرآیند های پاتولوژیک هم مهم هستند و از عوامل مهم پاتوژنز آترواسکلروز، آنوریسم آئورت، آمفیزم ریوی، بولوس پمفیگوس، سرطان و متاستاز هستند.
بیشتر بخوانید:
تشخیص هویت سلول ها با بررسی فعالیت اختصاصی آنزیم ها
بعضی از سلول ها فعالیت آنزیمی اختصاصی دارند. مثلا سلول های کبدی آنزیم آرژیناز و سلول های اندوتلیال آنزیم فسفاتاز قلیایی دارند. البته لازم است این نکته توجه داشت که در خیلی از این سلول ها بعد از کشت در محیط آزمایشگاهی و پاساژ سلولی متعدد کاهش شدید فعالیت آنزیمی را شاهد هستیم که احتمالا به خاطر تغییر محیط رشد و عدم دریافت سیگنال های لازم است.
سلول های بافت کبدی چند روز پس از کشت فعالیت آرژینازی خودشان را از دست می دهند و چرخه ی اوره در آنها متوقف می شود، در سلول های اندوتلیال هم کاهش فعالیت فسفاتاز قلیایی اتفاق می افتد. با این حال استثناء هم وجود دارد و بعضی تیره های سلولی همیشه فعالیت آنزیمی اختصاصیشان را حفظ می کنند. مثلا تیره سلولی سرطان کبد موش صحرایی از آن جمله است که فعالیت تیروزین آمینوترانسفرازی اختصاصی خودش را همیشه و تحت هر پاساژ سلولی حفظ می کند.
البته باید توجه کنیم که بعضی از این آنزیم ها بطور ذاتی ترشح می شوند و ترشح بعضی از آنها هم قابل القاء است. گروه دوم برای دست ورزی ما روی تکنیک تشخیص سلول ها با توجه به فعالیت آنزیمی آنها مناسب تر است. یعنی اینکه می شود با اضافه کردن مکمل هایی به محیط کشت آنها، سلول ها را وادار به ترشح آنزیمی کرد و بعد تیره ی آنها را تشخیص داد.
به عنوان مثال در صورت استفاده از گلوتامات بجای گلوتامین در محیط کشت سلولی، فعالیت آنزیم گلوتامیل سنتتاز که از آنزیم های اختصاصی سلول های استروگلیای مغز است چندین برابر افزایش پیدا می کند. به طور کلی برای القاء و یا افزایش فعالیت آنزیمی سلول ها از هورمون های گلوکوکورتیکوئیدی همانند دگزامتازون یا هورمون های پلی پپتیدی ازجمله انسولین و گلوکاگون استفاده می شود. علاوه بر این با کاهش غلظت محصولات آنزیم مورد نظر و یا تغییر غلظت سوبسترای آنزیم می شود توان تولید آنزیم های ذکر شده را القا کرد.
برای دریافت خدمات مربوط به تشخیص هویت سلول ها و انجام انواع تست های آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک خدمات آزمایشگاهی می توانید اقدام نمایید
تشخیص هویت سلول ها با بررسی فعالیت پروتئازی
بعضی از این پروتئاز ها مخصوص سلول های خاصی هستند.مثلا تریپسین، رنین، کلاژناز و آنتی ژن اختصاصی پروستات توسط سلول های خاص ترشح می شوند. پس قطعا الگوی ترشحی آنها می تواند در تشخیص افتراقی و تعیین منشاء سلول های مختلف مورد استفاده باشد.
گاهی از این پروتئاز ها جهت مصارف صنعتی یا تحقیقاتی استفاده می شود بنابراین شناخت الگوی ترشحی آنها بسیار مهم است. همانطور که می دانید کلاژناز برای جداسازی سریع سلول ها از بافت و تریپسین برای جدا شدن سلول های چسبیده به کف پلیت در آزمایشگاه ضروری هستند.
پروتئازها با توجه به مکانیسم عملکردشان به چهار خانواده ی: سرین پروتئاز ها، متالوپروتئیناز ها، آسپارتیک پروتئازها و سیستئین پروتئازها تقسیم می شوند ولی تعداد کمی شان هم هنوز در خانواده ی خاصی نیستند. مطالعات نشان می دهد که در بعضی از بیماری ها تعادل بین پروتئازها با مهارکننده های طبیعی آنها بهم می خورد و باعث تخریب بافت یا تغییراتی در ساختمان بافت می شود. پس طبیعیه که تولید مهارکننده های اختصاصی این آنزیم ها جزء پروژه های مهم شرکت های داروسازی قرار بگیرد.
بیشتر بخوانید:
