✍ روشهای کاربردی جهت تشخیص هویت سلول ها

کاربردهای ایزوآنزیم ها در آزمایشگاه

ایزوآنزیم ها گروهی از آنزیم ها هستند که در گونه های مختلف جانداران وجود دارند. آنها خصوصیات آنزیمی مشابهی دارند اما از نظر ساختمانی یا ژنتیک باهم اختلاف دارند. حرکت الکتروفورزی این ایزوآنزیم ها به ترکیب اسیدآمینه های زیرواحد های خود بستگی دارد. مثلا لاکتات دهیدروژناز ۵ شکل ایزوآنزیمی مختلف دارد که هرکدام از آنها توسط سلول های بافت خاصی تولید می شوند و با اعداد یک تا پنج نامگذاری می شوند. سلول های گونه های مختلف جانداران دارای ترکیب متفاوتی از این ایزوآنزیم ها هستند. بنابراین با مطالعه ی ایزوآنزیمی تیره های سلولی می شود منشاء بافتی و حتی گونه ی حیوانی سلول را تعیین کرد. این تکنیک همچنین برای شناسایی آلودگی های متقاطع تیره های سلولی با همدیگر کاربرد دارد. مشخصا می دانیم آلودگی متقاطع تا چه حد در کشت و پاساژ سلول هایتان مهم است و چقدر می تواند در کارتان تاثیرگذار باشد.

در این بین بررسی ایزوآنزیم های استراز، پورین نوکلئوزید فسفوریلاز، گلوکز شش فسفات دهیدروژناز و لاکتات دهیدروژناز اهمیت زیادی دارند.

با توجه به الگوی فعالیت و ترشح ایزوآنزیم های مختلف آنزیم هایی که ذکر کردیم، در سلول های مختلف، جدول های مرجعی تهیه شده که به کمک این جدول ها، می توان سلول های گونه های مختلف جانداران را از هم متمایز کرد. برای انجام چنین آزمایشی باید تعداد مناسبی سلول توسط بافر هیپوتونیک یا با روش فریز و روش دفریز کردن لیز شده و لیزات سلولی الکتروفورز شده و بر روی آن سوبسترای  اختصاصی آنزیم اضافه شود تا با توجه به محل قرار گیری باندهای بدست آمده ، نوع ایزوآنزیم و میزان فعالیت آن مشخص شود.

دومین تکنیک مهم  استفاده از شاخص های آنتی ژنتیکی است. خیلی از سلول ها دارای شاخص های سطحی اختصاصی هستند. مثلا CD34 یکی از شاخص های اختصاصی واقع در سطح سلول های بنیادی خون است. از سال ۱۹۵۷ با معرفی تکنیک تولید آنتی بادی های مونوکلونال ، شناسایی اختصاصی چنین شاخص هایی در سطح سلول ها خیلی آسان شده. به کمک آنتی بادی هایی که علیه شاخص های سطحی سلول ها تولید شدند، علاوه بر شناسایی انواع سلول ها می شود آنها را از هم تفکیک کرد. این آنتی بادی ها بطور اختصاصی به آنتی ژن های هدف متصل می شوند بنابراین می شود بطور غیر مستقیم مولکول های نشانگر، مثل آنزیم ها یا مواد فلورسنت متصل به خود را به هدف موردنظر وصل کنند. با ردیابی ماده نشانگر می توان از اتصال یا عدم اتصال آنتی بادی به هدف مطلع شد.

تکنیک ایمونوفلورسانس

تکنیک ایمونوفلورسانس یکی از تکنیک هایی است که کاربرد زیادی در شناسایی مولکول های سطحی سلول ها دارد. در این تکنیک مولکول نشانگر مواد فلورسنت مثل فلورسئین ایزوتیوسیانات یا رودامین و… هستند که به طور شیمیایی به آنتی بادی موردنظر متصل شدند . آنتی بادی های اختصاصی گران قیمت هستند برای همین در این آزمون ها برای صرفه جویی در مصرف آنتی بادی ها از لام های مخصوص که دارای حفره های کاذب کوچک هستند استفاده می شود. در صورتی که امکان دسترسی به این لام ها وجود نداشته باشد ، می توان با استفاده از ماژیک های ضد آب حفره ی کاذبی روی لام ایجاد کرد و سوسپانسیون سلولی با رقت مناسب را روی آن اضافه کرد. این سلول ها باید بطور یکنواخت روی لام پخش شوند و سلول ها روی هم نیوفتند. لام ها بعد از خشک شدن، با متانول یا هر فیکساتور مناسب دیگری ثابت شده و آماده ی رنگ آمیزی می شوند.

دستورالعمل/ روش کار آزمون ایمونو فلورسانس

آزمون ایمونو فلورسانس به دو روش مستقیم و غیرمستقیم قابل انجام است.

در روش مستقیم آنتی بادی های اختصاصی شاخص مورد نظر با مواد فلورسنت نشان دار شده و بعد از تهیه ی رقت لازم مستقیما روی سلول ها اضافه می شوند. بعد از تمام شدن زمان انکوباسیون، لام ها در بافر حاوی اوانس بلو شسته شده و بعد از خشک شدن بر روی آنها محلول مانت اضافه می شود و لام ها با میکروسکوپ ایمونو فلورسنت مطالعه می شوند. معمولا برای شستشوی لام ها از بافر فسفات با pH بین ۷.۲ تا ۷.۴ استفاده می شود. بدین ترتیب که ابتدا معرف روی لام ها با بافر مربوطه شستشو داده می شود و بعد لام ها در داخل جارهای مخصوص شستشوی لام در داخل بافر غوطه ور می شوند و چند دقیقه در داخل جار تکان داده می شوند تا مواد اضافی که بطور غیراختصاصی به لام چسبیده شسته شده و از محیط عمل خارج شوند. برای ایجاد کنتراست بیشتر، بهتر است چند قطره اوانس بلو هم به بافر اضافه کرد تا زمینه ی سلول ها قرمز تا ارغوانی شود و نواحی فلورسنت شده بهتر قابل تشخیص و تمایز بشوند.

در روش غیر مستقیم که حساسیت بیشتری دارد، ابتدا آنتی بادی اختصاصی شاخص مورد نظر بدون کونژوگه شدن با مواد فلورسنت روی سلولها افروده می شود و بعد از اتمام زمان انکوباسیون لام ها شسته شده و آنتی بادی دوم که در واقع علیه شاخص های آنتی ژنیک آنتی بادی اول بوده و با مواد فلورسنت کونژوگه شده اضافه می شود. بعد از اتمام زمان انکوباسیون، مثل روش مستقیم، لام ها در بافری که حاوی رنگ اوانس بلو  هست شسته شده و بعد از خشک شدن روی آنها محلول مانت اضافه شده و با میکروسکوپ ایمونوفلورسنت بررسی  می شوند. با توجه به اینکه کونژوگه کردن آنتی بادی ها باعث از دست رفتن مقداری از آنتی بادی می شود، معمولا از روش غیرمستقیم که نیاز به کونژوگه کردن کردن آنتی بادی اولیه ندارد استفاده می شود. آنتی بادی ثانویه علیه شاخص های آنتی ژنیکی آنتی بادی اولیه بوده و بصورت تجاری وجود دارد و خیلی ارزان تر از آنتی بادی کونژوگه اختصاصی شاخص خاص است. روش غیر مستقیم با توجه به حساسیت بیشتر و مرقون به صرفه بودن رایج تر است.

تکنیک فلوسایتومتری

تکنیک فلوسایتومتری شبیه آزمون های ایمونوفلورسانس است با این تفاوت که سلول ها به صورت سوسپانسیون بوده و آنتی بادی های مورد نظر به سوسپانسیون سلولی اضافه می شوند. برای ردیابی هم به جای میکروسکوپ از دستگاه فلوسایتومتر استفاده می شود که از نظر مکانیسم اولیه شبیه به میکروسکوپ ایمونوفلورسنت است. بعضی از دستگاه های فلوسایتومتری مجهز به سیستم جداسازی سلول ها هم هستند و به ما اجازه می دهند که بتوانیم سلول هایی را که دارای شاخص سطحی موردنظر ما هستند، جداکنیم. به عنوان مثال با کمک این دستگاه ها می توان سلول های بنیادی خون را که دارای شاخص CD34 هستند از خون جدا کنیم. در صورتیکه به عنوان مولکول ردیاب از آنزیم ها استفاده شود، بعد از تمام شدن آزمایش می شود لام ها را با میکروسکوپ معمولی هم بررسی کرد.در این روش که به نوعی تکنیک ایمونوهیستوشیمی است، آنتی بادی ثانویه با یکی از آنزیم های پراکسیداز تربچه ی کوهی یا فسفاتاز قلیایی تهیه شده از روده گوسفند کونژوگه می شود و روی سلول هایی که قبلا در مجاورت آنتی بادی اولیه قرار گرفتن اضافه می شود. پس مراحل تکنیک تا اینجا شبیه روش ایمونوفلورسنس غیرمستقیم است. در مرحله ی بعد سوبسترای اختصاصی آنزیم اضافه می شود و بعد از اتمام زمان انکوباسیون واکنش توسط اسید متوقف شده و لام ها بعد از شستشو با میکروسکوپ معمولی بررسی می شوند.

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش اول

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش دوم

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش سوم