✍ شناسایی SNP ها و جهش ها و انجام Association Study با استفاده از Tetra ARMs PCR

در این تکنیک ما از ۴ پرایمر به صورت همزمان برای یک واکنش استفاده می کنیم پس طراحی پرایمر برای ما اهمیت زیادی دارد .

طراحی پرایمر ها به گونه‌ای  انجام می شود که بتوان دو واکنش PCR با پرایمر مختص الل نرمال و پرایمر مختص الل موتانت را هم زمان در یک واکنش PCR بررسی کرد.

در اینجا ما باید ابتدا یک جفت پرایمر عمومی Outer Forward  و Outer Reverse   برای ناحیه ی دو طرف جهش البته با فاصله ی متفاوت از جهش مورد نظرمان طراحی می کنیم چون چنان چه جهش در میان دو پرایمر باشد شناسایی درمراحل بعدی برای ما غیر ممکن می شود، سپس ۲ پرایمر داخلی Inner Forward   و Inner Reverse را طراحی می کنیم  که انتهای ۳′ آن ها دقیقا  SNP مورد نظر ما باشد به گونه ای که مثلا به صورت قراردادی برای درک بهتر انتهای ۳′ پرایمر  Inner Forward نوکلئوتید مکمل آلل موتانت و انتهای ۳′ پرایمر Inner Reverse  نوکلئوتید مکمل آلل نرمال می باشد.

حال هر ۴ پرایمر طراحی شده را در یک ویال حاویDNA   نمونه می ریزیم و PCR را در داخل ترموسایکلر انجام می دهیم .

در واکنش PCR با پرایمرهای ذکر شده سه محصول می‌توانند تکثیر می شوند

محصول اول، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (outer forward) و پرایمر  (outer reverse) می باشد. این قطعه تکثیر شده باید در هر دو توالی حاوی آلل موتانت و توالی حاوی آلل نرمال مشاهده شود. و در واقع به عنوان کنترلی برای صحت PCR به کار می‌رود.

محصول دوم، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (outer forward) و پرایمر  (Inner reverse) می باشد. به دلیل اینکه  پرایمر (Inner reverse) طبق مثال قرار دادی مان تنها به توالی الل نرمال متصل می‌شود، بنابراین این قطعه تکثیر شده باید تنها در توالی دارای آلل نرمال دیده شود.

محصول سوم، محصول حاصل از تکثیر قطعه بین پرایمرهای (inner forward) و پرایمر(outer reverse) می باشد. به دلیل این که طبق مثال ذکر شده (inner forward) تنها به توالی دارای الل موتانت متصل می‌شود، بنابراین این قطعه تکثیر شده فقط باید در توالی دارای آلل موتانت مشاهده شود .

حال از تفاوت طولی که محصولات با هم دارند با بردن آن ها روی ژل آگارز بالای ۲% و ژل پلی آکریل آمید می توان به راحتی تعیین ژنوتیپ را انجام داد.

افراد هموزیگوت نرمال یا موتانت فقط ۲ محصول را روی ژل نشان می دهند که با توجه به پرایمرهایی که طراحی کردیم و تفاوت طولشان می توان تشخیص داد که فرد کدام یک ازآن هاست، ولی؛ افراد هتروزیگوت که در واقع هر دو آلل نرمال و موتانت را با خود حمل می کنند ۳ باند را روی ژل به ما نشان می دهند.