✍ پروتکل/روش کار استخراج RNA با ترایزول

استخراج  یکی از حساس ترین ماکرومولکول های حیات (RNA) که این کار مقدمه ی بسیاری از پژوهش های مولکولی مهم است. استخراج RNA فرآیند تخلیص RNA از موجودات زنده می با­شد که مکانیسم های مولکولی متفاوتی به منظور استخراج RNA  وجود دارد. طی این عمل سلول و یا بافت تخریب شده و ترکیبات داخلی آن خارج می شود سپس مولکول  RNA از مولکول های DNA و پروتئین جدا می شود و خالص می شود. آنزیم  RNAse قادر به تخریب RNA  موجود در محیط است که توسط تمام موجودات تولید و به محیط وارد می شود و حضور آن در محیط فرآیند استخراج  RNA را با مشکل مواجه می کند. امروزه یکی از موثرترین روش های استخراج RNA از نمونه­ های بیولوژیک استفاده از معرف گوانیدین تیوسیانات-فنل است که در دنیا با نام­های تجاری TRIzol، TRI reagent، QIAzol و … عرضه می شود.

۱- چنانچه از بافت استخراج می کنید، برای هموژن کردن، بافت‌ را با استفاده از ازت مایع؛ داخل یه ظرف (ترجیحا هاون چینی) بکوبید یا بافت را توسط سونیکاتور و یا هموژنایزر در محلول TRIzol لیز کرده و سانتریفیوژ کنید .  فقط حواستون به سرعت و دقت عمل هم باشد؛ تا RNAی شما در دمای محیط تخریب نشود.

۲- چنانچه استخراج از خون انجام می شود مقداری خون را در تیوب ریخته و دوبرابر حجم خون آب مقطر سرد به آن اضافه نمائید.

به منظور لیز گلبول های قرمز چندین مرتبه به شدت تکان(shake) کرده و ۱۰ تا ۱۵ دقیقه به صورت متناوب با قرار دادن میکروتیوب بر روی یخ و قرار دادن در دمای اتاق، شوک حرارتی به نمونه دهید.

–   افزایش گرانروی خون در نمونه نشانگر لیز شدن گلبول­های قرمز است.

–   میکروتیوب را در دمای ترجیحا ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ کنید.

–    این مرحله را تا زمان شیری رنگ شدن رسوب (pellet) و عدم مشاهده رنگ قرمز تکرار نمائید (حداقل سه مرتبه).

۳- محلول رویی را دور ریخته و بر روی رسوب ترایزول بریزیدکه از تمامیت ساختار RNA طی مراحل استخراج RNA محافظت می نماید. چندین مرتبه tap و در ادامهshake نموده تا محلول یکنواخت شود. ۱۰ تا ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه نمائید

۴- کلروفورم سرد به میکروتیوب اضافه کرده و۳۰ ثانیه به شدت تکان دهید.۱۰ الی ۱۵ دقیقه میکروتیوب را در دمای اتاق قرار دهید و سپس میکروتیوب حاوی نمونه را در ۱۴۰۰۰ rpm در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفوژ نمائید. در پایان این مرحله سه فاز مشخص می­شود.

۵- فاز آبی رویی را به میکروتیوب جدید RNase free سرد منتقل نموده و بر روی آن به میزان هم حجم، ایزوپروپانل ( و یا دو برابر حجم، اتانل مطلق) سرد بریزید. چندین بار میکروتیوب را سر و ته کرده و به مدت حداقل ۲۰ دقیقه در فریزر  – ۲۰ درجه سانتیگراد قرار دهید.

در این مرحله می­توان برای مدت زمان طولانی­ تری RNA را در فریزر قرار داد. این امر خود موجب افزایش راندمان استخراج RNA خواهد شد. سپس میکروتیوب را به مدت ۲۰ دقیقه با دور ۱۴۰۰۰۰ rpm در دمای  ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ نمائید.

۶- سوپرناتانت را تخلیه کرده و بر روی رسوب ml1 اتانل ۷۵% سرد اضافه کنید. چند مرتبه پیپتاژ کرده و سپس ۱۰ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد با دور ۱۰۰۰۰ rpm سانتریفیوژ نموده تا RNA رسوب کند.

۷-سوپرناتانت را خارج کرده و در محیط اجازه semi dehydration به RNA استخراج شده دهید.

۸- بسته به میزان RNA استخراج شده، ۲۰ الی ۵۰ میکرولیتر DEPC treated water اضافه کرده و با پیپتاژ کردن رسوب RNA را حل نمائید.