✍ دستورالعمل/ روش رنگ آمیزی مستقیم و غیر مستقیم در تکنیک ایمونوهیستوشیمی 

روش مستقیم یک روش رنگ آمیزی تک مرحله ای است و شامل یک آنتی بادی نشانگر دار شده (آنتی سرم کونژوگه شده FITC) است که به طور مستقیم با آنتی ژن در قطعه های بافت واکنش نشان می دهد. در این روش از تنها یک آنتی بادی استفاده می شود و بنابراین روش ساده و سریعی است، اما برخلاف روش های غیرمستقیم، حساسیت آن کمتر است. با این حال، این استراتژی کمتر از روش چند فاز استفاده می شود.

روش غیر مستقیم شامل یک آنتی بادی اولیه بدون نشانگر (لایه اول) است که به آنتی ژن هدف در بافت متصل می شود و یک آنتی بادی ثانویه دارای نشانگر (لایه دوم) که با آنتی بادی اولیه واکنش نشان می دهد. همانطور که در بالا گفتیم، آنتی بادی ثانویه باید روی IgG گونه های جانوری که در آن آنتی بادی اولیه قرار گرفته، سوار شود. این روش نسبت به روش مستقیم حساسیت بیشتری دارد.

در تکنیک های ایمونوهیستوشیمی چند مرحله قبل از رنگ آمیزی نهایی آنتی ژن بافت وجود دارد، که می تواند مشکلات مختلفی مثل رنگ آمیزی پس زمینه قوی، رنگ آمیزی آنتی ژن هدف ضعیف و اتو فلورسانس ایجاد کند. بیوتین درونزا یا آنزیم های گزارشگر یا واکنش متقاطع آنتی بادی اولیه / ثانویه از دلایل اصلی رنگ آمیزی پس زمینه قوی هستند، در حالی که رنگ آمیزی ضعیف ممکن است بخاطر فعالیت ضعیف آنزیم یا قدرت اولیه آنتی بادی ایجاد شود. علاوه بر این، اتو فلورسانس ممکن است بخاطر ماهیت بافت یا روش تثبیت باشد. این جنبه های آماده سازی بافت IHC و رنگ آمیزی آنتی بادی ها باید بطور منظم مورد بررسی قرار بگیرند که مشکلات رنگ آمیزی شناسایی و حل شوند.

نشانگرهای تشخیصی IHC

IHC یک روش تشخیص عالی است و از این مزیت فوق العاده برخوردارد که می تواند یک پروتئین معین در بافت مورد بررسی را دقیقاً مشخص کند. علاوه بر آن یک روش مؤثر برای بررسی بافت ها هم است. این امر آن را به یك روش گسترده در علوم اعصاب تبدیل كرده و به محققان کمک می کند كه بیان پروتئین در ساختارهای خاص مغز را بررسی كنند. نقطه ضعف اصلی IHC این است که، برخلاف تکنیک های سیستم ایمنی که رنگ آمیزی با یک نردبان (Ladder) با وزن مولکولی مشخص بررسی می شود، نمی توانیم در IHC نشان دهیم که رنگ آمیزی با پروتئین مورد نظر مطابقت دارد. به همین دلیل، آنتی بادی های اولیه باید به روش وسترن بلات یا روشی مشابه به خوبی تأیید شوند. این روش حتی بیشتر در آسیب شناسی جراحی تشخیصی برای تومورهای ایمنی استفاده می شود، مثلا برای e-cadherin برای تمایز بین DCIS و LCIS .تکنیکهای ایمونوهیستوشیمی در تشخیص افتراقی اشکال مختلف سرطان غدد بزاقی، سر و گردن مفید هستند. تنوع مارکرهای IHC مورد استفاده در آسیب شناسی جراحی تشخیصی زیاد است. خیلی از آزمایشگاههای بالینی در بیمارستانها بیش از ۲۰۰ آنتی بادی دارند که به عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی، پیش آگهی و پیش بینی کننده مورد استفاده قرار می گیرند. نمونه هایی از برخی نشانگرهایی که معمولاً استفاده می شوند عبارتند از:

BrdU: برای شناسایی سلولهای در حال تکرار استفاده می شود. برای شناسایی تومورها و همینطور در تحقیقات علوم اعصاب استفاده می شود.

سیتوکراتین ها: برای شناسایی کارسینوما استفاده می شود اما ممکن است در بعضی از سارکوم ها هم بیان شود.

CD15 و CD30: برای بیماری هوچکین استفاده می شود

Alpha fetoprotein: برای تومورهای کیسه زرده و سرطان سلولهای کبدی کاربرد دارد

CD117 (KIT): برای تومورهای استرومایی دستگاه گوارش (GIST) و تومورهای ماست سل

CD10 (CALLA): برای سرطان سلول کلیوی و لوسمی لنفوبلاستیک حاد

آنتی ژن اختصاصی پروستات (PSA):برای سرطان پروستات شناسایی لنفومهای B-cell با استفاده از CD20 شناسایی لنفومهای T-cell با استفاده از CD3.

انواع مسیرهای مولکولی در سرطان تغییر پیدا می کنند و بعضی از تغییرات ممکن است در درمان سرطان هدف گیری شوند. از ایمونوهیستوشیمی می شود برای ارزیابی اینکه تومورها با تشخیص حضور یا افزایش سطح مولکول هدف ، به درمان پاسخ می دهند ، استفاده کرد. بسیاری از تومورها وابسته به هورمون هستند. وجود گیرنده های هورمونی می تواند مورد استفاده قرار بگیرد تا مشخص شود آیا تومور به طور بالقوه به درمان ضد هورمونی پاسخ می دهد یا خیر. یکی از اولین روشهای درمانی ضد استروژن، تاموکسیفن بود که برای درمان سرطان پستان مورد استفاده قرار می گرفت. چنین گیرنده های هورمونی را می شود با ایمونوهیستوشیمی تشخیص داد.

Imatinib، یک مهار کننده تیروزین کیناز داخل سلولی، برای درمان لوسمی میلوژن مزمن، یک بیماری که با تشکیل تیروزین کیناز غیر طبیعی تشخیص داده می شود، ایجاد شد. Imatinib در تومورهایی که بیانگر سایر تیروزین کینازها هستند، مؤثرتر از KIT است. بیشتر تومورهای استرومایی دستگاه گوارش KIT را بیان می کنند که با ایمونوهیستوشیمی قابل شناسایی است.

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC) – بخش اول

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش دوم

تکنیک ایمونوهیستوشیمی (IHC )– بخش سوم