✍ کاربرد های استفاده از روش HRM 

این تکنیک جهت تشخیص موتاسیون های ژنتیکی با اختلافات موجود در توالی نوکلئیک اسید است،که به محقق توانایی تشخیص سریع و دسته بندی جهش های ژنتیکی (به عنوان مثال SNPs)، شناسایی ژنتیکی بدون انجام سکانس یابی یا تشخیص اختلالات ژنتیکی در یک جمعیت (به عنوان مثال تنوع ویروس ) قبل از انجام سکانس یابی را می دهد

.این تکنیک که ابتدا توسط شرکت ایداهو و دانشگاه یوتا ابداع شد،دارای مزایایی بیش از تکنیک ژنوتایپینگ است

* نسبت به دیگر تکنولوژی های ژنوتایپینگ مثل توالی یابی و Taq man SNP typing ارزان تر است.

* این تکنیک سریع و قدرتمند است، بنابراین قادر است به سرعت بسیاری از نمونه ها را تعیین ژنوتیپ کند.

*کار کردن با این روش آسان است، با استفاده از یک آنالیز HRM با کیفیت ژنوتایپینگ، می توان در آزمایشگاه غیر ژنتیک که دستگاه RealTime PCR با قابلیت HRM را دارند، انجام داده و تأیید کرد.

اساس HRM شبیه به آنالیز منحنی ذوب که به آن آنالیز منحنی ذوب با وضوح پایین گفته می شود ، می باشد.

تفاوت بین آن ها ،اختلاف دمای خواندن هر فلورسنس می باشد. در طول آنالیز منحنی ذوب با وضوح پایین، افزایش دما ۰/۵ درجه به صورت پله ای انجام می گیرد، اما در HRM این افزایش دما بین ۰/۰۰۸ تا ۰/۲ درجه اتفاق می افتد، که اجازه ی آنالیز با جزئیات بیشتر در زمان ذوب شدگی را می دهد.

تکنیک HRM بر روی DNA دو رشته ای انجام می شود. به طور معمول کاربر قبل از انجام HRM، برای ازدیاد ناحیه ی مورد نظر از DNA ،یک PCR استاندارد انجام داده ، که در تیوب نمونه میلیون ها کپی از ناحیه ی مورد نظر DNA  تولید خواهد شد. فرآیند HRM شامل گرمادهی دقیق قطعه ی DNA از تقریبا ۵۵-۵۹ درجه سانتی گراد است . در طول این فرآیند ، بعضی از قطعات به دمای ذوب قطعه رسید و دو رشته ی DNA جدا یا ذوب می شود. رنگ هایی که برای HRM استفاده می شوند، به عنوان رنگ های درج شونده بین دو رشته شناخته می شوند. در آغاز آنالیز HRM ،افزایش سطح فلورسانس در نمونه به خاطر وجود میلیون ها کپی از قطعه است، اما هر چه نمونه گرم تر می شود و دو رشته از هم باز می شود، میزان دو رشته ای DNA کاهش یافته و در نتیجه میزان فلورسانس کاهش می یابد. ماشین HRM  دارای یک دوربین است که این پروسه را به وسیله ی اندازه گیری فلورسانس تماشا می کند. دستگاه سپس به سادگی اطلاعات را به صورت گراف به عنوان منحنی ذوب، میزان فلورسانس در مقابل درجه حرارت نشان می دهد. دمای ذوب قطعه ی DNA در حال باز شدن کاملا قابل پیش بینی است که این بستگی به توالی بازهای DNA دارد. اگر شما در حال مقایسه ی دو نمونه از دو نفر مختلف هستید، آن ها باید به شکل یکسان منحنی ذوب داشته باشند. اگر فردی دارای موتاسیون در ناحیه ای از DNA است، شما دو منحنی ذوب متفاوت مشاهده می کنید. تفاوتی که ممکن است کوچک باشد، شاید کسری از درجه، اما چون ماشین HRM قابل به دیدن این پروسه با وضوح بالاست، این تغییرات را به دقت ثبت و جهش را شناسایی می کند.

حساسیت HRM و اطمینان بخشی از انجام آن با استفاده از رنگ های جدید درج شونده بین دو رشته افزایش یافته است. کاربردهای استفاده از HRM در حال گسترش است  :

ژنوتایپینگ SNP و کشف جهش (اسکن ژن)

غربالگری هتروزیگوسیتی

انگشت نگاری DNA

شناخت خصوصیات بلوک های هاپلوتیپ

آنالیز متیلاسیون DNA

نقشه برداری ژنتیکی و شناسایی گونه ها

تشخیص تنوع جمعیت های باکتریایی و ویروسی

تکنیک HLA تایپینگ

مطالعات مورد-شاهدی

انواع مختلفی از رنگ های درج شونده بین DNA دو رشته وجود دارد، که دارای خواص متفاوت و مجزایی هستند. رنگ های استفاده شده در HRM با رنگ های معمولی برای RealTime PCR استاندارد فرق دارند. فاکتورهای مؤثر در qPCR مثل نسبت سیگنال به نویز و بازده تکثیر برای انجام HRM مورد نیاز نمی باشد. در عوض رنگ مورد استفاده در HRM باید اطلاعات دقیقی از رفتار ذوب شدگی قطعه ی هدف به ما بدهد. در حالت ایده آل نباید رنگ به بازهای پورین و پیریمیدین متصل شود، Tm قطعه را تغییر ندهد و یا باعث مهار تکثیر شود.

تکنیک آنالیز منحنی ذوب DNA با وضوح بالا (HRM)

بررسی داده های به دست آمده از منحنی ذوب با وضوح بالا (HRM)

مشکلات رایج در منحنی ذوب با دمای بالا (HRM)  و اصلاح روش

رنگ ها و دستگاه های مورد استفاده در HRM