✍ بررسی کنترل ها، نمونه اصلی و آنالیز منحنی ذوب جهت رفع اشکالات منحنی تکثیر

کنترل مثبت: به جهت اطمینان از درست انجام شدن واکنش و نیز سالم بودن مخلوط واکنش از کنترل مثبت استفاده می شود. می توانید از نمونه ی بیمار مثبت یا نمونه ای که از داشتن هدف مورد نظرتان اطمینان دارید، استفاده کنید. یکی از بهترین مواردی که می توانید به عنوان کنترل مثبت استفاده کنید، منحنی استاندارد می باشد.

کنترل منفی :یا کنترل فاقد الگو (NTCs)، به منظور بررسی آلودگی مخلوط واکنش در آزمایش مورد بررسی قرار می گیرد و مثبت شدن آن نشان از آلودگی مخلوط واکنش دارد و نمی توان به داده های حاصل از نمونه های اصلی اعتماد کرد. البته در مواردی که حل مشکل آلودگی ممکن نباشد، می توان با بررسی نتایج نیز جواب قابل اعتمادی به دست آورد، به این صورت که اگر Ct کنترل NTC در سیکل ۳۵ تا ۴۰ قرار بگیرد و Ct نمونه اصلی در سیکل ۲۵ یا کمتر بود ( در واقع اختلاف ۱۰ سیکل بین نمونه ی اصلی و کنترل NTC در صورتی که Ct کنترل بین ۳۵ تا ۴۰ باشد ) می توان به جواب نمونه ی اصلی اعتماد کرد. در صورت قرار گرفتن Ct کنترل NTC در سیکل های پایین تر از ۳۰، به احتمال زیاد آلودگی در مخلوط واکنش وجود دارد و نمی توان به جواب آزمایش اعتماد کرد .

نمونه اصلی: بعد از تنظیم و بررسی مراحل بالا، نوبت به بررسی نمونه های اصلی مورد آنالیز می باشد. نمونه های اصلی نیز باید دارای منحنی تکثیر مناسب باشد، تکثیر باید به صورت واقعی صورت بگیرد، که در این صورت میزان ΔRn در فاز سکون منحنی تکثیر باید بیشتر از ۰/۵ باشد. اگر تکثیری وجود نداشت، فلورسانس پروب یا پرایمر یا بررسی کنید. اگر فلورسانس وجود داشت، پروب سالم می باشد و احتمالا الگوی واکنش از بین رفته یا اصلا در مخلوط واکنش الگو اضافه نکرده اید. اگر فلورسانس وجود نداشت، کلا بررسی نمونه زیر سؤال است و آن را از داده هایتان حذف کنید. نباید اختلاف Ct بین تکرار نمونه های حداکثر بیشتر از ۰/۵باشد ( در هر عملیات واکنش PCR هر نمونه مورد آنالیز را باید ۳ بار تکرار کنید)، که در این صورت دارای ضریب تغییرات (CV) کمی نسبت به هم خواهند بود. اگر در بین تکرار ها، نمونه ای دارای Ct کمتر یا بیشتر بود، می توان به میزان الگویی که اضافه کرده اید شک کنید، دو برابر بودن الگو میزان Ct را یک سیکل کاهش می دهد .

اگر Ct نمونه های اصلی دو سیکل های ۳۵  تا ۳۹ قرار بگیرد، برای اطمینان به این که سیگنال نمونه بالاتر از پس زمینه قرار می گیرد و سیگنال ناشی از آلودگی یا مسائل دیگر نیست، دو کار می توانید انجام دهید؛ یا الگوی مخلوط واکنش را دو برابر کنید که در این صورت باید Ct واکنش یک سیکل کم تر شود، یا تعداد سیکل های واکنش را به ۵۰ سیکل افزایش دهید تا اختلاف ۱۰ سیکل بین نمونه ی اصلی و نمونه ی کنترل بدون الگو مشاهده شود و اگر این اختلاف مشاهده نشد، نشان از آلودگی می باشد.

آنالیز منحنی ذوب: در روش استفاده از رنگ های آزاد، برای بررسی عملکرد پرایمر های طراحی شده و اطمینان از این که پرایمر فقط به هدف مورد نظر متصل شده و تکثیر به درستی و با اختصاصیت کافی انجام شده است، می توانید با بررسی آنالیز ذوب نتایج را تفسیر کنید، در واقع وجود منحنی تکثیر فقط می تواند نشان از یک تکثیر باشد و واقعی بودن یا نبودن اختصاصیت آن باید تأیید شود، که می توان از منحنی آنالیز ذوب استفاده کرد. همان طور که گفته شد، افت فلورسنس بر روی منحنی نمودار منحنی ذوب به صورت قله دیده می شود که در واقع برای مشاهده ی راحت تر نمودار این چنین نمایش داده می شود .

برای درک بهتر یک مثال برایتان خواهیم گفت، اگر اندازه ی قطعه ۱۳۰ جفت باز و دمای Tm محصول PCR ما ۸۰ درجه سانتی گراد باشد این انتظار را داریم که در منحنی آنالیز ذوب فقط یک پیک فلورسانس در محل دمای Tm که ۸۰ درجه است داشته باشیم. اگر دو پیک فلورسانس در منحنی آنالیز ذوب مشاهده شد، نشان از تکثیر دو قطعه ی تولیدی می باشد و پرایمر طراحی شده به صورت غیر اختصاصی به یک توالی دیگر متصل شده است. احتمال زیاد اگر پیک دوم در دمای ۷۵ درجه سانتی گراد مشاهده شد، نشان از تشکیل دایمر پرایمر و غیر بهینه بودن واکنش دارد. توجه داشته باشید که در هنگام طراحی پرایمر، نرم افزار به شما دمای ذوب قطعه ی تولیدی را خواهد داد و شما می توانید بر اساس آن منحنی آنالیز ذوب خود را بررسی و آنالیز کنید.

 تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم(مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)