✍ ماندگاری کشت، هاروست و تهیه کروموزوم

کشت coverslip که آماده شد، دو یا سه قطره فیکساتیو را برای برداشتن لامل از ظرف اضافه کرده و گستره های مناسب از کروموزوم های CVS تهیه کنید. کشت های لوله یا فلاسک ها می بایست بعد از ۳-۲ روز بررسی شوند، و وقتی رشد را مشاهده کردید، محیط عوض شود. معمولا پس از بیشتر از ۲ روز، محیط دوباره عوض می شود، و یا روزانه تعویض شده تا برای هاروست آماده شود. هاروست و تهیه اسلاید قبلا برای مایع آمنیوتیک شرح داده شده است.

روش کار/پروتکل کشت بافت های جامد مثل C.V.S و P.O.C

۱-برای آماده سازی نمونه جهت کشت، در صورتیکه نمونه C.V.S باشد بصورت زیر عمل کنید:

الف) نمونه مورد نظر را شستشو داده تا از خون و موکوس عاری شود.

ب) سپس با سر سوزن بافت های مادری، از قبیل خون را جدا کنید.

ج) سپس با اسکالپل استریل، نمونه را به قطعات بسیار ریز تقسیم کرده، و از نمونه حاصل، سوسپانسیون سلولی تهیه کنید، و با توجه به مقدار نمونه، و نوع ظرف به آن، محیط اضافه کنید.

۲- تمامی مراحل دیگر کاملا مشابه کشت AF است.

برای کشت نمونه های P.O.C با توجه به اینکه کدام بافت را برای کشت برداشتیم C.V.S، پوست یا بند ناف یا کیسه آمنیوتیک به صورت زیر انجام دهید:

الف) نمونه مورد نظر را شستشو داده (با محیط) تا از خون و موکوس عاری شود.

ب) سپس با اسکالپل استریل آن را به قطعات بسیار ریز تقسیم کرده و سوسپانسیون سلولی را کشت دهید.

۴- بعد از ۷-۵ روز نمونه را به آرامی از انکوباتور خارج و با invert microscope آن را بررسی کنید. در صورت مشاهده کلونی، محیط آن را برداشته و با محیط تازه تعویض کنید.

۵- دو روز در میان ،نمونه ها را با invert microscope بررسی کرده و محیطش را عوض کنید.

۶- بعد از رشد کلونی به اندازه کافی می توانیم یکی از لوله ها را هاروست کنیم و لوله دیگر را subculture دهیم.

۷- subculture دادن نمونه، به این صورت است که نمونه مورد نظر را انتخاب کرده، سپس محیط آن را در لوله ای جداگانه می ریزیم. سپس نمونه را با PBS با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد شستشو داده و محلول آن را به لوله فوق اضافه می کنیم.

۸- الف- در لوله Lighton 0.5cc و به فلاسک ۱ cc  محلول trypsin-EDTA(1X) با دمای ۳۷، درجه سانتیگراد بریزید و آن را به مدت ۳۰ ثانیه درون ۳۷ درجه سانتیگراد قرار دهید.

ب- با جدا شدن سلول از سطح ظرف کشت، برای خنثی کردن اثر trypsin به آن ۱cc محیط کامل حاوی سرم اضافه کنید.

ج-  سپس با توجه به مقدار نمونه درون ظرف های دیگر آن را aliquot  می کنیم و در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد قرار می دهیم. ( قسمت ۳و۷ فقط برای subculture دادن نمونه ها است).

۹- برای هاروست، به ازای هر ۱cc حدودا ۷۵ میکرولیتر کلسمید اضافه کرده، و ۴-۳ ساعت در ۳۷ درجه انکوبه کنید. پس از این مدت طبق قسمت شماره ۷ سلول ها را trypsinized کنید و سوسپانسیون سلولی رو در لوله جداگانه نگهداری کنید.

۱۰- بعد از جدا شدن و جمع آوری سوسپانسیون، آن را به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰rpm سانتریفوژ کنید.

۱۱- supernatant را برداشته و به آن محلول هایپوتونیک ۰.۰۶ M از KCL اضافه کنید و به مدت ۱۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.

۱۲- سپس سانتریفوژ کرده، و بعد از حذف supernatant به آن Fix 3:1 5cc (متانول: اسیداستیک) اضافه کرده و ۲۰ دقیقه آن را  به همین حالت قرار دهید.

۱۳- بعد از ۲۰ دقیقه، نمونه را سانتریفوژ کرده و مجددا fix اضافه کنید و۲۰ دقیقه دیگر در همین حالت قرار دهید.

۱۴- سپس نمونه را سانتریفوژ، و غلظت سوسپانسیون را جهت لام گیری آماده کرده، و از نمونه لام گیری کنید.

مراحل ۸-۱ در شرایط استریل انجام می شود.

هفت روز بعد از کشت، نمونه ها را از انکوباتور خارج کنید و با میکروسکوپ اینورت مشاهده کنید و در صورت مشاهده کلونی ( سلول های دوکی شکل) محیط را با محیط تازه عوض کنید. پس از دو روز نمونه ها از انکوباتور خارج و در زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده کنید، و اگر دیدید که نمونه ها رشد کافی دارند، آن ها را برای ساب کالچر و هاروست مستقیم بردارید.

روش کار/نحوه انجام ساب کالچر

محیط رویی لیتون را در یک فالکون ۵۰ خالی کنید. با PBS  ۰.۵cc شستشو و در فالکون خالی کنید. دوباره PBS 0.5cc و در فالکون خالی کنید. حال ۰.۵ cc تریپسین EDTA را در لیتون ریخته و بگذارید به مدت ۳۰ ثانیه، در دمای ۳۷ درجه بماند. بعد از اون لیتون را خارج کرده، و ضربه به لبه انکوباتور بزنید، و سپس در زیر میکروسکوپ اینورت مشاهده کنید. در صورتی که سلول ها گرد شده بودن، یعنی اینکه کار شما درست و سلول ها تریپسینایز شدند. و اگر بلند نشده بودند، باید کمی صبر کنید. بعد بر روی آن  ۳ cc محیط تازه آمنیومکس بریزید (جهت توقف عمل تریپسین)، و به دو لوله لیتون تقسیم کنید و در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد بگذارید و ۴۸-۱۲ ساعت هاروست کنید. بهتر است که لوله ها را ۱۲ ساعته هاروست کنید، یعنی ۸ شب ساب کالچر، و ۸ صبح هاروست کنید. اگر چند ساعت بعد از ساب کالچر، نمونه ها را مجددا با میکروسکوپ اینورت ببینید، متوجه می شوید که سلول ها چسبیده اند.

روش کار/نحوه انجام هاروست

به یکی از لوله های کم سلول تر، ۰.۵ cc کلسمید افزوده و لوله را در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد، به مدت ۴-۳ ساعت بگذارید. سپس هاروست را شروع کنید. ابتدا محلول رویی(سوپرناتانت) را در یک فالکون بریزید. و بار دوم با PBS 0.5 cc شستشو داده و در فالکون بریزید. بار آخر ۰.۵ cc تریپسین EDTA بر روی سلول ها ریخته و بگذارید ۳۰ ثانیه یا ۰.۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتیگراد بماند. پس از آن لوله را خارج کرده و محتویات فالکون روبر روی آن بریزید و هاروست را شروع کنید.

ابتدا بگذارید به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۳۰۰ ساتریفوژ شود. و بعد از آن محلول روئی را خالی کرده و برروی آن ۸ cc محلول هایپوتونیک بریزید، و به آرامی بهم بزنید، و بگذارید ۵ دقیقه در بن ماری ۳۷ درجه و یا انکوباتور ۳۷ درجه بماند. سپس سه قطره فیکس بر روی آن ریخته و بگذارید به مدت ده دقیقه با دور۱۰۰۰ سانتریفوژ شود. بعد لوله را خارج کرده محلول رویی را بیرون ریخته و بر روی آن ابتدا  ۳ccفیکس ۳:۱ قطره قطره اضافه کنید، و سپس ۵-۹cc فیکس بعدی رو بر روی آن اضافه کنید. سپس لوله را به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۳۰۰ سانتریفوژ کنید، و سپس لوله را خارج کرده محلول رویی را بیرون بریزید، و بر روی آن مجددا ۱۲cc فیکس  آرام آرام اضافه کنید. سپس لوله را به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۳۰۰ سانتریفوژ کرده و سپس لوله رو خارج کرده و محلول رویی را بیرون ریخته (در همه مراحل از پیپت پاستور برای کشیدن محلول رویی و دور ریختن آن استفاده کنید). سپس بر روی آن چند قطره فیکس ریخته و لام گیری کنید. لام گیری از فاصله نزدیک، بر روی لام های تمیز شده با اتانول، انجام می شود، یعنی در واقع لام گیری touch است. برای ایجاد شرایط بهتر لام گیری، از یک چراغ مطالعه و دستمال کاغذی خیس که لام ها را برروی آن می گذارید، و چراغ مطالعه که بخار ایجاد می کند، می شود استفاده کرد.

کشت ‌CVSزیر هود لامینار

نمونه مورد نظر را در یک پتری دیش استریل ریخته و سپس برروی آن  PBS بریزید تا کاملا خون آن شسته شود، همچنین پرزها را رگ های خونی را جدا کنید. چندین بار این شستشو را ادامه دهید و با پیپت پاستور در زیر هود، محیط پس مانده را عوض کنید. در پایان وقتی کاملا پرزها و رگ های خونی جدا شد و PBS سفید و بافت نیز سفید بود، کار را شروع کنید قبل از شروع ۱ cc کلاژناز و ۰.۵cc  تریپسین EDTA اضافه کرده، با اسکالپل و پنس نمونه را با پنس گرفته و با اسکالپل ضربات متوالی و سریع به بافت بزنید، تا کاملا خرد شود بعد از اینکه به قطعات ریز تقسیم شد، از سوسپانسون حاصل، در چهار لوله لیتون کشت دهید، و روی هر کدوم ۱.۵ cc محیط آمنیومکس اضافه کنید. بعد در انکوباتور ۳۷ درجه بگذارید بماند. بعد از ۷-۵ روز نمونه ها را از انکوباتورخارج کرده، و در زیر میکروسکوپ اینورت بررسی کنید. در صورت رشد کلونی های سلولی و حالت خوشه ای، رشد سلول های دوکی، نمونه را یا هاروست واگر رشد کافی نداشت تعویض محیط کنید.

تذکر: پروتکل ها بر اساس setup آزمایشگاه ها متفاوت است

تست Chorionic Villus Sampling – CVS (نمونه برداری از پرزهای کوریونی)

کشت Chorionic Villus Sampling – CVS (نمونه برداری از پرزهای کوریونی )

تکنیک Chorionic Villus Sampling – CVS (ماندگاری کشت، هاروست و تهیه کروموزوم)