✍ سنجش نرخ زنده مانی سلول ها به منظور دستیابی تعداد سلول های شناور درون محیط کشت

یکی از راه های تشخیص زنده مانی سلول ها این است که سلول ها را با یک رنگ اختصاصی رنگ کنیم و سپس شمارش سلول های زنده را آغاز کنیم. رنگ مورد استفاده امکان این تشخیص را می دهد که متوجه شویم کدام سلول زنده است.

در تکنیک کشت سلول اولیه سلول ها را پس از پر کردن کف پلیت با کمک آنزیم تریپسین جدا می کنیم و بعد از سانتریفیوژ، سلول ها ته نشین و آماده ی پاساژ بعدی می شوند. سلول هایی که داخل فالکون، بعد از سانتریفیوژ و پس از خارج کردن مایع رویی(محیط کشت) قرار دارند را با محیط کشت به حجم۱ml می رسانیم. به این نکته توجه کنید که “به حجم ۱ml می رسانیم” نه اینکه۱ml محیط کشت به آن اضافه کنیم. سپس بر روی یک قسمت از لام نئوبار (یک لام مشبک و مخصوص شمارش) ۵µl تریپان بلو اضافه می کنیم. تریپان بلو رنگ اختصاصی است که سلول های زنده مانع از ورود رنگ به درون خودشان می شوند و فقط سلول های مرده تریپان بلو را جذب می کنند. این رنگ همانطور هم که از اسم آن پیداست رنگ آبی به سلول های مرده می دهد. بعد از گذاشتن رنگ، به همان میزان یعنی۵ µl ، سلول به رنگ اضافه کرده و سپس سلول ها و رنگ را خوب پیپتاژ می کنیم تا رنگ بتواند به سلولهای مرده نفوذ کند. اکنون۵µl محلول حاوی سلول و رنگ داریم. یک لامل را به صورت لوزی روی قسمت مشبک لام نئوبار قرار می دهیم و محلول رنگ و سلول ها را روی یکی از رئوس لامل می ریزیم. لام به دلیل خاصیت مشبک بودنش محلول را به زیر لامل می کشد.

دستورالعمل شمارش سلول ها

لام را زیر میکروسکوپ با لنز ۱۰ می بریم و سلول های شفاف و رنگ نگرفته ی موجود در هر ۴ ناحیه ی لام را شمارش کرده و در آخر برای داشتن میانگین، تعداد کل را تقسیم بر ۴ می کنیم.

• در ابتدای کار، فالکون حاوی سلول ها را به حجم۱ml رساندیم.
• حال می خواهیم نتیجه ی شمارش سلول های روی لام نئوبار را به آن۱ml  تعمیم دهیم.

فرمول طلایی و نهایی شمارش:

تعداد سلول های شمارش شده × ۲ (ضریب رقت رقیق کردن با تریپان بلو) ×  ۱۰به توان ۴ (ضریب حجم) به این صورت می توانید تعداد سلول های زنده در حجم کل بدست بیاورید.