✍ انواع روش ها و ژل های الکتروفورز

آگارز

آگارز به شکل پودر سفید است که به آن آب جوش اضافه می گردد، و هنگامی که سرد می شود حالت ژله ای به خود می گیرد. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر و اسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰جفت باز از آگارز ۳ %و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸ %درصد استفاده می شود.

اﻧﺪازه ﺣﻔﺮه ﻣﻮﺟﻮد در ژل، ﺑﺴﺘﮕﯽ ﺑﻪ ﻏﻠﻈﺖ آﮔﺎرز در ﺑﺎﻓﺮ دارد .ﻫﺮ ﺑﺎﻧﺪ ﺗﻔﮑﯿﮏ ﺷﺪه ﺣﺎوي ﭼﻨﺪﯾﻦ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﺎ ﺣﺮﮐﺖ اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي ﯾﮑﺴﺎن ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ. در اﯾﻦ ﻧﻮع از ﻣﺤﯿﻄﻬﺎي اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي  ﺑﺎﻧﺪﻫﺎ ﺑﯿﺸﺘﺮ ﺑﻪ ﺻﻮرت ﭘﻬﻦ دﯾﺪه ﻣﯽﺷﻮﻧﺪ زﯾﺮا ژل آﮔﺎرز ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻣﺤﯿﻄﻬﺎي دﯾﮕﺮ ﻣﺎﻧﻨﺪ اﺳﺘﺎت ﺳﻠﻮﻟﺰ ﻧﺴﺒﺖ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻨﻬﺎ از ﻧﻔﻮذﭘﺬﯾﺮي ﺑﺎﻻﯾﯽ ﺑﺮﺧﻮردار ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ.

استات سلولز

کاغذها بیشتر از این حائز اهمیت هستند که جنبه جداسازي ترکیبات با وزن مولکولی پایین را دارند. مزیت اصلی این محیط ها نازك بودن و قدرت مکانیکی آنهاست. این محیط ها حساسیت زیادی دارند، زیرا به نمونه کمتري براي باندهاي قابل تشخیص نیاز دارند. استات سلولز بوسیله قرار دادن کاغذ سلولز در مجاورت انیدرید استیک ایجاد می گردد که گروه استیل بر روي گروه هاي هیدروکسیل قند قرار می گیرد.

پلی آکریل آمید

ژل پلی آکریل آمید در برابر حرارت پایدار بوده و شفاف است و همچنین فاقد بار الکتریکی می باشد به همین دلیل تداخلی که در ژل آگارز وجود داشت در اینجا وجود ندارد. به دلیل سرطان زا بودن باید دقت کافی را داشت تا با پوست دست تماس پیدا نکند.

نحوه ی آماده سازی این ژل به گونه ای ست که با تغییر میزان پودر، منافذ موجود در ژل تغییر می کند. اکریل آمید برای جداسازی پروتئین هایی با اندازه ی ۵ تا ۲۰۰۰ کیلو دالتون است. برای ساخت این ژل از آب مقطر، محلول اکریل آمید،Tris  ، SDS استفاده می شود . در اینجا ما دو عدد شیشه داریم که این محلول باید بین این دو ریخته شود. هنگام ریختن ژل با مراقب باشیم حباب هوا ایجاد نشود. سپس شانه را درون ژل قرار می دهیم.

رنگ آمیزي ژل هاي الکتروفورزي (Staining):

دلیل رنگ آمیزي ژل های الکتروفورزي، آشکار شدن جایگاه باندهاي پروتئین و … است. انتخاب رنگ ها با توجه به نوع ژل و نوع ترکیب مورد جداسازي صورت می گیرد. میزان رنگ هر باند با میزان پروتئین موجود در آن باند ارتباط دارد ولی این میزان تحت تاثیر عوامل دیگري نظیر نوع پروتئین و میزان دناتوراسیون آن قرار می گیرد. وقتی از رنگ آمیزي پروتئین ها استفاده می شود بخش لیپیدي لیپوپروتئین ها یا کربوهیدراتی گلیکوپروتئین ها رنگ نمی شود. لذا مقادیر آنها کمتر از میزان واقعی برآورد خواهد شد.

رنگ های مورد استفاده برای انواع ژل:

۱- پروتئین : آمیدوبلاك ،کوماسی بریلیانت بلو و نیترات نقره

۲- لیپوپروتئین : سودان بلاك ،  کوماسی بریلیانت بلو و Oil Red 0

۳- گلیکوپروتئین : Periodic Acid Schiff (PAS)

۴- اسیدهای نوکلئیک : اتیدیوم بروماید و نیترات نقره

۵- دهیدروژناز : NADH(داراي خاصیت فلوئورسان) و نمک تترازولیوم

انواع روش ها در تکنیک الکتروفورز:

الکتروفورز به ۲ روش افقی و عمودی انجام می شود . از سوي دیگر براساس نوع محیط پایه و مواد شیمیایی مورد استفاده و همچنین نوع مکانیسم جداسازي, روش هاي الکتروفورزي تنوع زیادي پیدا کرده اند. ازجمله می توان انواع زیر را نام برد:

۱- الکتروفورز بر روي ژل آگارز (AGE or Electrophoresis Gel Agarose)

۲- الکتروفورز بر روي استات سلولز (CAE or Electrophoresis Acetate Cellulose)

۳- الکتروفورز بر روي ژل پلی آکریل امید (PAGE or Electrophoresis Gel Polyacrylamide)

 تکنیک الکتروفورز – بخش اول

 تکنیک الکتروفورز – بخش دوم