✍ کاربرد تکنیک پاساژ سلول های نیمه چسبان در آزمایشگاه های سلولی

دو نوع  رده سلولی چسبنده و معلق داریم. دسته ی دیگری از سلول ها را  داریم که مابین دو رده ی قبلی قرار می گیرند. این سلول ها، مانند تیره ی سلولی B95-8-Marmoset، سلول های نیمه چسبان هستند و رفتارشان به صورت مجموعه ای از سلول های چسبیده و شناور رشد می کنند. یک درصد به فلاسک می چسبند و بقیه شناورمی مانند. این ویژگی از خصوصیات رشد این سلول هاست و زمان پاساژ دادنشان هم باید این خصوصیت حفظ شود و کشت و پاساژ همزمان برای سلول های چسبیده و شناور انجام شود

دستورالعمل/روش کار تکنیک پاساژ سلول های نیمه چسبان

۱-ابتدا سلول ها را با میکروسکوپ invert بررسی می کنیم تا هم میزان تراکم سلولی را بررسی کنیم‌، هم مطمئن شویم خبری از باکتری ها و بقیه ی آلودگی ها نیست.

۲-چند بار با کف دستمان به فلاسک ضربه های ملایم می زنیم تا آن سلول هایی که اتصال ضعیفی به فلاسک دارند جدا شوند و سلول های شناور هم به حالت سوسپانسیون دربیایند.

۳-کل محیط کشت و سلول های شناور را به یک لوله ی استریل منتقل می کنیم.

۴- برای سلول های چسبیده هم باید یک فکری بکنیم. سلول ها را با بافر فسفات بدون کلسیم و منیزیم شستشو می دهیم.(به ازای هر ۲۵ سانتی متر مربع فلاسک ، ۲تا ۳ میلی لیتر بافر فسفات اضافه می کنیم).

۵-محلول حاصل از شستشو را به سلول های قبلی اضافه می کنیم. چون حاوی مقدار زیادی سلول زنده است و اول قانونمان در کشت سلول این بود که سلول ها را تا جایی که ممکن است از دست ندهیم.

۶-به ازای هر ۲۵ سانتی متر مربع از فلاسک، یک میلی لیتر محلول تریپسین/EDTA به سلول های شسته شده کف فلاسک اضافه می کنیم. فلاسک را بصورت افقی و دورانی حرکت دهید که تریپسین روی همه ی سلول ها اثر کند.

۷-فلاسک را برای ۲ تا ۱۰ دقیقه در انکوباتور می گذاریم. دقت کنید که سلول های نیمه چسبان برای تریپسینه شدن به مدت زمان کمتری نسبت به سلول های چسبان نیاز دارند.

۸-فلاسک را از انکوباتور خارج می کنیم و  باکف دست ضربه می زنیم تا سلول های جدا نشده هم بالاخره جدا شوند و برای اطمینان از جدا شدنشان با میکروسکوپ invert فلاسک را بررسی می کنیم.

۹-سلول های جدا شده را به لوله حاوی بقیه سلول ها اضافه می کنیم. اگر محیط قبلی سرم داشت که همان سرم برای غیر فعال شدن تریپسین کفایت می کند.اگر نه، سرم خالص یا محیط حاوی سرم به آن اضافه می کنیم.

۱۰-لوله ی حاوی سلول ها را سانتریفیوژ می کنیم و مایع رویی را دور می ریزیم. رسوبی که می ماند همان سلول های ارزشمند هستند.این رسوب را در حجم مناسبی از محیط کشت تازه به حالت سوسپانسیون درمی آوریم و شمارش سلولی را انجام می دهیم.

۱۱-مقدار مناسبی از سلول ها را در فلاسک های جدیدی که برچسب زده شدند می ریزیم و به مقدار کافی به آن ها محیط کشت تازه اضافه می کنیم.

۱۲-و در آخر با توجه به سرعت رشدشان هر ۲ یا ۳ روز یکبار، پاساژ را تکرار می کنیم.

تکنیک پاساژ سلولی (cell passage)