✍ روش کار با میکروسکوپ TEM

میکروسکوپ الکترونی ۲نوع است .

میکروسکوپ الکترونی عبوری Transmission electron microscop  که تصویر از اجزای داخلی سلول تهیه می کند و میکروسکوپ الکترونی روبشی /Scanning electron microscope که از سطح سلول تصویر را می سازد. اما برای مطالعه برروی سلول با استفاده از میکروسکوپ الکترونی یکسری مقدماتی لازم است. و آن مقدمات درواقع تکنیک های آماده سازی سلول و یا بافت برای مطالعه هستند. قطعا در آزمایشگاه سلولی به نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونی نیاز پیدا می کنید.

برای TEM چون الکترون ها باید از نمونه عبور کنند، پس نمونه باید کاملا نازک و البته خشک باشد. در واقع درست است که نمونه هم در ابتدا دارای آب است اما در انتها باید به یک نمونه ی خشک و نازک که در یک ماتریکس پلاستیکی سخت شده تبدیل شود.

مراحل کار با میکروسکوپ الکترونی TEM

۱-ابتدا نمونه را بصورت اولیه فیکس می کنیم، بعد آن را شستشو داده، مرحله ی دوم فیکساسیون را انجام می دهیم، مرحله بعد آبگیری، بعد از آن نوبت نفوذ پذیری با حلال و سپس رزین است و در آخر کار قالب گیری و پختن رزین را انجام می دهیم.

۲-فيكساسيون اوليه بافت را با غوطه ور كردن (Immersion) انجام می دهیم. در immersion بافت بلافاصله بعد از بيوپسي در يك بافر مناسب با تيغ تيز يا اسكالپل به قطعاتی به ابعاد كمتر از mm 0.5 می بریم و در ويال حاوی محلول گلوتارآلدئيد غوطه ور مي کنیم. توجه کنید که در این مرحله بافت اصلا نبايد خشك شود.

۳-بعد از فيكساسیون اوليه معمولا بافت در همان بافري كه فيكساتيو در آن تهيه شده شستشو می دهیم . اين شستشو خیلی مهم است چون بخشهائي از گلوتارآلدئيد كه واكنش نكرده و داخل بافت باقی مانده را به حداقل می رساند. شستشوي اوليه به مدت ۱۰ دقيقه انجام می شود و شستشوي ثانويه ۳-۱ ساعت طول می کشد.گاهی برای شستشوی ثانویه یک شب را هم سپری می کنند.

۴-مرحله ی بعد مرحله ی مهم آبگیری است. در این مرحله از حلال هایی مثل اتانول یا استن در درصد های مختلف استفاده می کنیم به این صورت که از ۳۰% شروع می کنیم با درصد های ٥٠ ، ۷۰، ۹۵ ادامه می دهیم و درآخر با درصد ۱۰۰ برای سه بار آبگیری را انجام می دهیم. حلال دیگری را که می تواند رزین را در خودش به خوبی حل کند، جایگزین اتانول شود. این حلال واسط و انتقالی است و به صورت استاندارد از اكسيد پروپيلن (Propylene oxide) استفاده می شود. برای اینکه این حلال کاملا جایگزین الکل ۱۰۰ درصد شود، ۲ تا تعویض ۳۰ دقیقه ای لازم است.

۵-بعد از این مرحله مونومرهای رزین مایع که خیلی هم ویسکوز هستند باید جایگزین حلال انتقالی شوند. حلال اکسید پروپیلن را با رزین مخلوط می کنیم و کم کم به مقدار رزین اضافه می کنیم تا در آخر بافت به طور کامل در رزین قرار بگیرد. اگه ویال حاوی بافت را روی شیکر بگذاریم، نفوذ رزین هم بهتر رخ می دهد.

۶-در مرحله ی قالبگیری، محیط قالبگیری باید بتواند به نحوی پلیمریزه شود که تمام قسمت های بافت بصورت جامد و سخت دربیایند که معمولا از محیط ایپاکسی رزین استفاده می شود.

۷-مرحله ی آخر هم پختن رزین است که برای ایپاکسی رزین ها در حرارت ۶۰ درجه سانتیگراد و برای ۲-۳ روز انجام می شود