✍ کاربردهای تکنیک RFLP 

 یکی از روشهای تشخیص جهش ها و پلی مورفیسم ها در ژنوم، که  تکنیک PCR-RFLP با استفاده از آنزیم‌های محدودگر است.

دلیل اهمیت بررسی جهش‌ها در ژنوم چیست؟

اهمیت بررسی جهش ها در این است که ژنوم‌ موجودات‌ دارای‌ تفاوت‌هایی‌ در ردیف‌ بازهاشون است که این‌ تغییرات‌ طبیعی‌ که‌ باعث‌ گوناگونی‌ در افراد یک‌ جمعیت‌ می‌شود چند شکلی‌ ژنتیکی یعنی همون جهش یا پلی مورفیسم(جهشی که فراوانی آن در جامعه بیشتر از ۱% باشد) ‌نام‌ دارد و جهش‌ها از روشهای گوناگونی می‌توانند منجر به تغییر در فنوتیپ اصلی و بروز صفات جدید مثل بیماری یا سرطان بشن و به مطالعه شناسایی ارتباط جهش‌ها با بروز یک فنوتیپ خاص مطالعات همبستگی “association study” گفته می شود.

اگه یک جهش باعث از بین رفتن  یا برعکس باعث به وجود آمدن جایگاه برش برای یک آنزیم  محدودگر بشود، از هضم آنزیمی یک قطعه به وسیله ی آن آنزیم می توانیم به حضور یا عدم حضور آن جهش پی ببریم. برای انجام این تکنیک اول باید قطعه مورد نظرمون که می خواهیم از لحاظ حضور یا عدم حضور آن جهش بررسی کنیم را از طریق PCR تکثیر کنیم ولی باید دقت کنیم که پرایمرهایی که برای تکنیک PCR_RFLP طراحی می کنیم  باید از جهش و یا SNP  فاصله مناسبی از دو طرف داشته باشند به گونه ای که طول قطعات حاصل از هضم آنزیمی متفاوت باشد تا برامون قابل تشخیص باشد .

بعداز تکثیر ژن حاوی جهش مورد نظرمون به محصول PCR آنزیم محدودگر مناسب اضافه می کنیم که در واقع آنزیم های برشی دسته ای از آنزیم های آندو نوکلئاز به شمار میروند که یک ردیف اختصاصی از بازها را درون مولکول DNA دو رشته ای شناسایی می کنند و بعد در دمای مناسب برای فعالیت آنزیم انکوبه می کنیم در نهایت تعدادی قطعه با طول متفاوت ایجاد می شود، بعد از این کار نتایج بدست آمده از هضم آنزیمی را با استفاده از الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید یا ژل آگارز با در صد بالا (معمولا ۳ درصد) مشاهده می کنیم.

حالا نوبت به این می رسد که ببینیم که برای تعیین ژنوتیپ در انسان چطور از این تکنیک استفاده کنیم، از آنجایی که انسان دیپلوئید است و از هر ژن دو آلل دارد، می تواند سه تا ژنوتیپ هموزیگوت موتانت دارای دو آلل جهش یافته، هموزیگوت وحشی دارای دو آلل سالم یعنی جهش نیافته و در نهایت هتروزیگوت یعنی دارای یک آلل سالم و یک آلل جهش یافته داشته باشد. حالا با استفاده از آنزیم برشی می توانیم و بررسی قطعات حاصل شده از برش می توانیم پی ببریم که هر فردی چه نوع آللی دارد و آیا هموزیگوت است یا هتروزیگوت و اگه داریم تو یک جمعیت افراد را بررسی می کنیم فراوانی این ژنوتیپ و در نهایت تاثیرش یا عدم تاثیرش در بروز یک صفت خاص یا بیماری را با استفاده از نرم افزار SPSS که یک نزم افزار آنالیز آماری است، بررسی کنیم . البته متأسفانه برای توالی بعضی از جهش ها آنزیم برشی مناسب وجود ندارد برای همین باید از روش های دیگری استفاده کنیم.