✍ بررسی عوامل موثر بر اشکالات احتمالی منحنی تکثیر

زمانی که منحنی تکثیری دیده نمی شود یا منحنی تکثیر عجیب و غریبی دیده شود به اولین چیزی که می توان شک کرد این است که Data Collection خاموش باشد یا فقط اطلاعات مرحله ی دوم و سوم ذخیره شده است، دومین کاری که می توان انجام داد بررسی انتخاب صحیح کانال های رنگ است مثلا چنانچه رنگ TAMRA را برای پروب FAM انتخاب کرد بیشتر منحنی در زیر خط آستانه قرار می گیرد و نتیجه ی ضعیفی را نشان می دهد در حالی که تصحیح انتخاب درست کانال FAM باعث نمایان شدن منحنی تکثیر واقعی می شود و می توان از طریق بررسی و انطباق منحنی حاصل از تابش خام ( در وضعیت Raw spectra ) و منحنی Best fit اشتباه در انتخاب کردن کانال های رنگ را تشخیص داد که در صورت عدم انطباق این دو منحنی به انتخاب رنگ اشتباه و یا آلودگی یا رنگ دیگر در مخلوط واکنش پی برد .
زمانی که برای دستگاه سهوا چاهک بدون نمونه و خالی را به عنوان نمونه مورد آنالیز برای تعریف کنید، منحنی تکثیری که دستگاه به ما نشان می دهد، به صورت نامنظم با آستانه ی غیر منتظره می باشد (ظرف خالی نیز دارای مقدار بسیار کمی فلورسنس می باشد ). زمانی که از بلانک آب و یا از ROX به عنوان رنگ مرجع قرار است استفاده کنید، اما در مخلوط واکنش ROX وجود نداشته باشد نیز منحنی تکثیری را مشاهده می کنید .

حد پایه:

بعد از داشتن یک منحنی تکثیر با ۴ فاز استاندارد هر منحنی، نوبت به تنظیم حد پایه Baseline می رسد . حد پایه نویز در سیکل های اول است که به طور معمول بین سیکل های ۳ تا ۱۵ تعیین می شود، جایی که فلورسنس قابل تشخیص به وسیله ی دستگاه نیست. تعیین محل سیکل های مورد استفاده برای حساب کردن حد پایه می تواند تغییر کند و در مقادیر الگوی بالا یا اگر میزان بیان خیلی بالا باشد، نیاز به کاهش حد پایه می باشد. برای تصحیح حد پایه، اطلاعات فلورسنس را در گراف منحنی تکثیر با مقیاس خطی (به جای مقیاس لگاریتمی ) مشاهده کرده و حد پایه در محدوده ی بالا را در جایی که کم ترین Ct شروع شده، قرار می دهیم. برای مثال اگر کم ترین Ct برابر با ۱۵ باشد حد پایه که در محدوده ۶ تا ۱۵ قرار داشته را در محدوده ی ۶ تا ۱۳ قرار می دهیم ( قانون کلی تعیین حد پایه ،۲ تا ۳ سیکل کمتر از کمترین Ct را به عنوان سطح بالای حد پایه تعیین کنید )

آستانه:

بعد از انتخاب صحیح Baseline ،نوبت به انتخاب آستانه می رسد. آستانه به مرز بالای فلورسنس پس زمینه گفته می شود که در زیر فاز سکون از منحنی تکثیر قرار دارد . مقدار آستانه باید در فاز لگاریتمی منحنی تنظیم شود تا به آسانی در فاز لگاریتمی و فاز خطی قابل تشخیص باشد. اگر چندین هدف را بررسی می کنید ،باید آستانه را برای هر کدام به طور جداگانه تنظیم کنید. دستگاه به طور خودکار آستانه را ۱۰ برابر SD حد پایه تنظیم می کند.

اگر بخواهیم به طور دستی آستانه را تنظیم کنیم:

۱) آستانه باید در جایی از منحنی تکثیر باشد که فاز لگاریتمی همه نماهای منحنی را در بر بگیرد، نباید آستانه در فاز سکون و یا در اواخر فاز خطی باشد .

۲)آستانه باید در جایی از منحنی تکثیر قرار بگیرد، که حداکثر دقت تکثیر وجود دارد و تکثیر به درستی در همه ی نماهای منحنی تکثیر انجام شده باشد، که نشان دهنده ی بالاترین حساسیت تست باشد .

 تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم(مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)