✍  Realtime PCR چیست و چه تفاوت هایی با PCR عادی دارد؟

تکنیک RealTime PCR  که به آن Quantitative PCR یا PCRکمی نیز  می گویند به طور عمده در بررسی های کمی بیان ژن به کار می رود ولی در تعیین میزان ویروس های یک نمونه هم تکنیکی قوی و حساس به شمار می آید، البته این تکنیک کاربردهای فراوانی دیگری هم چون بررسی میزان تأثیر دارو درمانی، سنجش آسیب های DNA، تشخیص عوامل بیماری زا، تعیین ژنوتیپ افراد، سنجش تفکیک شدن آللی و … دارد.

در این روش از یک مولکول گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده پیشرفت PCR استفاده می شود و قدرت سیگنال فلوئورسنت تولید شده ارتباط مستقیمی با مقدار مولکول‌های تکثیرشده دارد. در این تکنیک میزان محصولاتی که حین یک آزمایش PCR تولید می‌شوند با میزان محصولات تولید شده طی آزمایش‌های PCR با مقدار نوکلئیک ‌اسید آغازکننده مشخص، مقایسه می‌شود و امکان پی بردن به مقدار نوکلئیک اسید اولیه موجود در نمونه، برای ما فراهم می شود.

بر مبنای ملکولی که برای تشخیص استفاده می شود این تکنیک به دو روش تقسیم بندی می شود:

 ۱-تشخیص غیر اختصاصی با استفاده از رنگ های باند شده به DNA

در اینجا از رنگ های باند شده به DNA به عنوان گزارشگر فلوروسنت برای مشاهده واکنش PCR استفاده می شود. این فلوروسنت در سیکل متوالی بر اثر مضاعف شدن افزایش می یابد. با ثبت مقدار فلوروسنت ساطع شده در سیکل، می توان واکنش را در طول مرحله نمایی مشاهده نمود. اگر نموداری میان لگاریتم مقدار شروع واکنش و افزایش فلوروسنت  گزارشگر ترسیم شود یک رابطه خطی مشاهده خواهد شد. اغلب از SYBR Green به همراه DNA دو رشته ای به عنوان رنگ مخصوص گزارشگر استفاده می شود. این رنگ به شکاف کوچک از مارپیچ دو رشته ای DNA باند می شود. در داخل محلول، رنگ هایی که باند نشده اند فلوروسنت  خیلی کمی را نشان می دهند و فلوروسنت  زمانی به وضوح  افزایش می یابد که رنگ به DNA دو رشته ای پیوسته شود. SYBR Green تحت شرایط PCR پایدار و با ثبات باقی می ماند. سطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشر طول موج ها می شود. همان طور که پیشتر ذکر شد از اتیدیوم بروماید نیز برای تشخیص می توان استفاده کرد ولی به علت سرطان زا بودن آن کمتر استفاده می شود.

۲-تشخیص اختصاصی با استفاده از شناساگرهای هدف

تکنیک دیگر استفاده از پروب گزارشگر (reporter probe) است که با اتصال به محصولات PCR سیگنال فلوئوروسنت ایجاد می‌کند و استفاده از آن معمول‌تر است. این تکنیک به Taq Manˊ ۵ nuclease assay معروف است. پروب به کار رفته در این فرایند از آن جهت reporter نامیده شده که نشانگر وجود محصول موردنظر است. محل اتصال پروب، به رشته الگو و نزدیک به پرایمرهای اصلی PCR و پایین‌تر از آن است. این متد کمتر در معرض خطاهایی قرار دارد که از اتصالات نادرست از جمله دایمرهای پرایمر حاصل می‌شود. در این حالت هر مولکول پروب متشکل از یک الیگونوکلئوتید و دو لیبل است. رنگ فلوئوروسنت به انتهای َ۵ رشته الیگونوکلئوتیدی و ترکیب quencher به انتهای دیگر رشته متصل می‌شود. این ترکیب وظیفه مهار سیگنال فلوئوروسنت را بر عهده دارد و این کار را با جذب انرژی از رنگ فلوئوروسنت انجام می‌دهد. این پدیده FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) نام دارد. در حالت عادی سیگنال فلوئوروسنتی ایجاد نمی‌شود؛ چون الیگونوکلئوتید به گونه‌ای طراحی شده است که دو انتهای آن با همدیگر مکمل شده و رنگ فلوئوروسنت و ترکیب quencher در کنار همدیگر قرار می‌گیرند. هیبریداسیون بین الیگونوکلئوتید و محصول PCR، اتصال بین دوسر الیگونوکلئوتید را بر هم می‌زند و این کار باعث ایجاد سیگنال فلوئوروسنت می‌گردد. در حین انجام‌ شدن PCR، پلیمراز Taq، با رسیدن به پروب با خاصیت اگزونوکلئازی ۳َ به  ۵َ خود آن را تجزیه می‌کند و با این کار رنگ و ترکیب quencher در محیط آزاد می‌گردند. هر چه محصولات تولید شده بیشتر باشند، پروب‌های بیشتری به توالی مکمل خود در این محصولات متصل می‌شوند. هر چه تعداد پروب بیشتری متصل شود، سیگنال فلوئوروسنت بیشتری حین آزاد شدن رنگ از quencher ایجاد می‌گردد. درنتیجه ارتباطی میان سیگنال‌های فلوئوروسنت ایجاد شده در Real-time PCR و مقدار توالی الگو وجود دارد.

تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم(مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)