✍  چگونه مشکلات آزمایش بررسی بیان ژن را برطرف کنیم؟

اگر هیچ محصولی دیده نشود دلایل احتمالی چیست و برای حل این مشکلات چه باید کرد؟

در صورتی که هیچ محصولی دیده نشود ( منحنی تکثیر دیده نشود ) می توان احتمال دلایل زیر را داد:

* ممکن است یکی از اجزای PCR حذف یا تخریب شده باشد. برای حل این مشکل باید از کنترل مثبت جهت اطمینان از عملکرد ترکیبات واکنش در آزمایش استفاده شود.

*احتمال دارد که سایبرگرین تخریب شده باشد برای اطمینان از صحت این رنگ که حساسیت خود را به راحتی از دست می دهد، باید جهت آنالیز محصول واکنش ، محصول را بر روی ژل آگارز بررسی کنیم اگر سایز مناسب قطعه روی ژل دیده شد پس در تشخیص دستگاه Real Time PCR مشکلی وجود دارد.

* ممکن است دمای اتصال خیلی بالا باشد که در این صورت باید دمای اتصال را ۲ تا ۴ درجه کاهش دهیم.

* شاید کیفیت الگو پایین باشد که در این صورت باید الگو را روی ژل آگارز بررسی کنیم ؛ شاید اصلٱ الگویی وجود نداشته باشد.

*ممکن است مدت زمان مرحله دناتوراسیون اولیه طولانی بوده باشد که در این حالت باید این مدت زمان را کاهش دهیم. Jump start Taq گاهی اوقات در دناتوراسیون بالای ۳ دقیقه تخریب می شود.

*این احتمال وجود دارد که الگوی هدف ساختار پیچیده ای داشته باشد. بیشتر اوقات ساختار ذاتی هدف به صورت غیر معمول غنی از GC و دارای ساختار ثانویه می باشد که می توان از DMSO با غلظت ۲ تا ۱۰ درصد یا بتائین با غلظت ۰/۸ تا ۱/۳ میلی مولار جهت رفع این مشکل استفاده کرد .

*شاید تعداد سیکل های انجام شده پایین بوده باشد که در این صورت باید تعداد سیکل های واکنش را افزایش دهیم.

*ممکن است میزان الگو کافی نبوده باشد که اگر این مشکل با افزایش تعداد سیکل ها حل نشد باید واکنش را با غلظت ۱۰ برابری الگو تکرار کنیم.

* احتمال دارد محصول PCR خیلی بلند باشد زیرا بهترین نتیجه زمانی رخ می دهد که محصول  PCR اندازه ای بین ۷۰ تا ۱۵۰ جفت باز داشته باشد پس در هنگام طراحی پرایمر F و R  باید به فاصله ی آن ها از هم توجه کرد تا با چنین مشکلی مواجه نشویم.

* ممکن است غلظت منیزیم غیر بهینه باشد. غلظت مناسب دامنه ای بین ۱/۵ تا ۵  میلی مولار دارد که غلظت بهینه در بیشتر موارد ۲/۵ میلی مولار است.

*احتمال دارد زمان اتصال کم بوده باشد که زمان اتصال به طور بهینه بین ۲۰ تا ۳۰ ثانیه است.

* احتمال دارد زمان طویل سازی کم بوده باشد. به لحاظ تئوری زمان طویل سازی به ازای هر ۲۰ جفت باز محصول ۱ ثانیه هست پس حداقل زمان لازم ۱۰ ثانیه می باشد.

*مقدار cDNA اضافه شده زیاد بوده باشد که این موضوع باعث خطی شدن منحنی تکثیر و کاهش بازده واکنش می شود. مقدار cDNA رقیق نشده نباید از ۱۰ درصد حجم کل مخلوط واکنش بیشتر باشد.

رفع مشکلات احتمالی در بررسی بیان ژن ( Real Time PCR Troubleshooting) – بخش اول

رفع مشکلات احتمالی در بررسی بیان ژن ( Real Time PCR Troubleshooting) – بخش دوم