✍ چگونه مشکلات آزمایش بررسی بیان ژن را برطرف کنیم؟

در مطلب گذشته به این موضوع  پرداختیم که اگر هیچ محصولی دیده نشود دلایل احتمالی چیست و برای حل این مشکلات چه باید کرد، در این مطلب برخی دیگر از مشکلات احتمالی را بررسی خواهیم کرد .

*در صورتی که چندین محصول PCR تولید شود می تواند به دلایل زیر باشد:

۱) پرایمر به طور بهینه طراحی نشده که در این صورت با BLAST کردن صحت شناسایی توالی موردنظر را تأیید کنید. می توان برای اختصاصی تر شدن نسبت به هدف طول پرایمر را افزایش داد.

۲) پرایمر ها تخریب شده اند که می توان آن ها را روی ژل پلی آکریل آمید بررسی کرد.

۳) غلظت منیزیم بهینه نشده است، این غلظت می تواند رنجی بین ۱/۵ تا ۵ میلی مولار داشته باشد که رنج بهینه در بیشتر موارد ۲/۵ می باشد.

۴) دمای اتصال خیلی پایین است که می توان ۲ تا ۳ درجه آن را افزایش داد.

۵) آلودگی DNA داریم که باید همه اجزای واکنش را از این لحاظ چک کرد. برای جلوگیری از آلودگی، مخلوط واکنش را نیز زیر هود درست کنید.

۶) دایمر پرایمر تشکیل شده است که می توان یک مرحله اختیاری جمع آوری اطلاعات بعد از مرحله طویل سازی ( در PCR سه پله ای ) به منظور اجتناب از دایمر پرایمر اضافه کرد.

۷) غلظت الگو خیلی زیاد است که باید آن را در مخلوط واکنش کم کرد.

۸) غلظت پرایمر زیاد است که می توان این غلظت را در سریال های ۲ برابر رقت کاهش داد( ۰/۱ میلی مولار، ۰/۰۵ میلی مولار، ۰/۰۲۵ میلی مولار و ۰/۰۱۲۵ میلی مولار).

۹) با DNA ژنومی آلوده شده که برای رفع این مشکل زمانی که در حال سنجش بیان RNA در نمونه هستید و از cDNA به عنوان الگو استفاده می کنید، تا جایی که ممکن است طراحی پرایمر بر اساس نواحی اتصالات اگزون_اگزون باشد.

* در صورتی که بازده واکنش خیلی بالا (بالاتر از ۱۱۰ درصد) باشد به احتمال زیاد به این دلیل است که چندین جایگاه برای اتصال پرایمر در واکنش وجود دارد که برای حل این مشکل باید یک آنالیز منحنی ذوب یا بررسی بر روی ژل آگارز انجام دهید و از نظر عدم وجود چند قطعه ی تولیدی چک کنید.

* چنانچه منحنی تکثیر غیر قابل تکثیر باشد به دلایل زیر است:

۱) رنگ رفرنس اشتباه انتخاب شده است یا غلظت آن مناسب نیست که در این صورت باید غلظت های مناسب رنگ رفرنس را طبق پروتکل های استاندارد استفاده کنید.

۲)در پوش تیوب ها محکم نبوده که در این صورت درپوش تیوب ها را محکم ببندید؛ حتی اگر تیوب خالی باشد (تیوب خالی در دستگاه نگذارید).

۳) دمای واسرشته اولیه طولانی بوده است که مدت زمان دناتوراسیون اولیه را به ۲ دقیقه کاهش دهید.

*چنانچه تکرارهای واکنش با هم در میزان Ct یا اطلاعات داده شده اختلاف داشته باشند به دلایل زیر است:

۱) خطای سمپل کردن باعث ایجاد نوسان می شود که برای این کار باید یک مخلوط واکنش کلی درست کرد و آن را در هر تیوب واکنش تقسیم کرد.

۲) واکنش خوب مخلوط نشده است که باید به آرامی مخلوط واکنش را spin یا سانتریفیوژ کنید.

* اگر فلورسنس قابل تشخیص نیست یا متغیر است می تواند به دلایل زیر باشد:

۱) دایمر پرایمر تشکیل شده است که همان گونه که قبلا̋ هم گفته شد یک مرحله اختیاری جمع آوری اطلاعات بعد از مرحله طویل سازی ( در PCR سه پله ای ) به منظور اجتناب از دایمر پرایمر اضافه کرد.

۲) سایبرگرین خوب مخلوط نشده است که در این حالت اگر از مخلوط واکنش آماده استفاده نمی کنید، در زمان ساخت مخلوط واکنش، از اضافه شدن سایبر گرین مطمئن شوید.

۳) دستگاه PCR آلوده شده است که در این صورت طبق پروتکل سازنده برای آلودگی زدایی اقدام کنید.

۴)منحنی تکثیر به حداکثر رسیده و سپس در غلظت های بالا الگو کاهش پیدا کرده است که برای رفع این مشکل باید شمار سیکل های واکنش را برای حد پایه کاهش دهید و حد پایه را تصحیح کنید.

* اگر کنترل بدون الگو مثبت شود به احتمال زیاد به دلایل زیر است:

۱) اجزای واکنش آلوده است که در این صورت باید اجزای واکنش را تعویض و از اجزای جدید استفاده کنید.

۲) آلودگی در زمان ساخت مخلوط واکنش رخ داده است که در این صورت اقدامات احتیاطی را رعایت کنید برای مثال می توان از تیپ های فیلتردار استفاده کرد و یا برای جلوگیری از انتقال مواد واکنش قبلی از UNG استفاده کرد.

رفع مشکلات احتمالی در بررسی بیان ژن ( Real Time PCR Troubleshooting) – بخش اول

رفع مشکلات احتمالی در بررسی بیان ژن ( Real Time PCR Troubleshooting) – بخش دوم