✍ سیکل منحنی تکثیر در روش سایبرگرین

RealTime PCR نوعی PCR می باشد که به توالی تکثیر شده به صورت کمی سنجیده می شود. برای این کار  از دستگاه real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) استفاده می شود که نوعی ترمال سایکلر می باشد که از یک سیستم اپتیکی بهره برده و میزان DNA هر نمونه توسط آن محاسبه می گردد.

زمانی که سنتز cDNA انجام شد، پس از آماده سازی نمونه به منظور ورود به سیکل های پلیمریزه شدن، به نمونه DNA رنگی تحت عنوان سایبر گرین (SYBR Green) که به DNA متصل می گردد، اضافه می گردد و یا از پروب استفاده می شود. دستگاه real-time PCR با خاصیت فلورسانتی سایبر گرین (SYBR Green)  و یا پروب برای هر نمونه یک گراف تکثیر ترسیم می کند که هر نقطه از گراف تکثیر نشان دهنده میزان اتصال سایبر گرین و یا پروب به رشته DNA می باشد و در نهایت گراف که در نمایشگر متصل شده به real-time PCR  نشان داده می شود ، به حد آستانه خود می رسد و این میزان نشان دهنده میزان DNA بیان شده در هر نمونه می باشد.

تکثیر توالی DNA هدف به صورت نمایی می باشد به این صورت که یک الگو به دو، دو الگو به چهار و چهار الگو به هشت الگو و …. تبدیل می‌شود و این روند ادامه پیدا می‌کند. در ابتدای تکثیر این موضوع درست به نظر می‌رسد. اما، تکثیر نمایی تا ابد ادامه نمی یابد و به طور معمول تا چرخه ۳۵ سرعت واکنش کاهش پیدا می کند. زیرا، مقدار پرایمرها و dNTPها کم می شود و بازده DNA پلیمراز کاسته شده است؛ دناتوراسیون DNA ها به طور کامل انجام نمی‌ شود؛ و محصولات واکنش توسط خاصیت نوکلئازی پلیمراز از بین می‌روند، در نتیجه واکنش وارد یک فاز خطی می‌شود. در این حالت مانند فاز لگاریتمی توالی‌های الگو به طور کامل دو برابر نمی‌شوند و بازده دیگر ۱۰۰% نیست. تا اینکه درنهایت تا چرخه ۴۰ام، واکنش وارد مرحله کفه می‌شود که توقف تکثیر اتفاق می‌افتد.

اگر منحنی میزان تکثیر محصول در Real time PCR را بر حسب سیکل ها ترسیم کنیم  یک منحنی  که شامل ۴ فاز می باشد ایجاد می شود که عبارت است از:

فاز اول/ فاز Baseline region / Linear ground phase : در این فاز میزان تکثیر محصولات به میزانی نیست که باعث افزایش نور فلورسنت شود. نور فلورسنت مشاهده شده در این فاز از cDNA، پرایمرها و رنگ های فلورسنت آزاد در محیط واکنش منتشر می شود به همین دلیل در این فاز میزان نور ساطع شده قابل ردیابی نیست و به صورت خطی می باشد .

فاز دوم / Exponential phase : در این فاز میزان محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود بنابراین میزان محصولات به صورت نمایی افزایش پیدا می کند.

فاز سوم / Log linear phase: که ترکیبات واکنش و کارایی آن ها را به اتمام است.

فاز چهارم / plateau phase : در این فاز، ترکیبات واکنش از بین می روند و دیگر محصولی تکثیر نمی شود به همین خاطر در میزان فلورسنت هیچ افزایشی دیده نمی شود و به اصطلاح ریل تایم در این مرحله اشباع شده است.

معمولا به صورت توافقی سیکلی که محصولات در آن وارد فاز exponential  می شوند و  سیگنال واقعی از noise  پس‌زمینه قابل تشخیص است را سیکل مرجع و در اصطلاح  cycle threshold و یا CT نامیده می‌شود.

 تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم(مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)