✍ واریانت های تکنیک MLPA (RT-MLPA و MS-MLPA)

یکی از این واریانت ها ،تکنیک RT-MLPA است که می‌تواند جهت تهیه پروفایل mRNAها استفاده شود. آنزیم لیگاز نمی تواند پروب‌هایی را متصل کند که به مولکول RNA متصل شده‌اند. به همین خاطر، واکنش RT-MLPA با رونوشت‌برداری معکوس mRNA و تبدیل آن به cDNA انجام می پذیرد. بعد از این مرحله، سایر واکنش مثل واکنش MLPA عادی انجام می‌شود.

واریانت دیگر، MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA)  است که به جهت تعیین کمی تعداد کپی‌ها و هم چنین تهیه پروفایل متیلاسیون انجام می شود. این روش در تشخیص بیماری‌های مربوط به حک‌گذاری و همچنین آنالیز نقایص مربوط به متیلاسیون در نمونه‌های توموری بسیار مفید است و کاربرد دارد.

تکنیک MS-MLPA

تکنیک Methylation-specific MLPA (MS-MLPA)  متدی نیمه-کمی به منظور تهیه پروفایل متیلاسیون می باشد. در این تکنیک، با استفاده از آنزیم محدودکننده حساس به متیلاسیون تعداد کپی در ترکیب تعیین می شود. امروزه از MS-MLPA  برای تعیین تغییرات اپی‌ژنتیکی به کار می رود. یکی از مهم‌ترین کاربردهای این تکنیک تشخیص بیماری‌های وابسته به حک‌گذاری ژنومی همچون بیماری پرادرویلی، آنجلمن، سندروم بک‌ویت ویدمن و … می‌باشد.

تکنیک MS-MLPA به صورت گسترده‌ای در آنالیز تومورها و بررسی غیرفعال شدن ژن‌های سرکوب‌کننده تومور در زمان رونویسی، که ممکن است باعث پیشرفت تومور و مقاومت به داروهای شیمی‌درمانی شود، کاربرد دارد. تشخیص نقص‌های موجود در الگوی متیلاسیون می‌تواند جهت آنالیز دقیق‌تر نوع تومور استفاده شود. پروتکل MS-MLPA بسیار شبیه روش استاندارد MLPA است. آن چه این دو را از هم متفاوت می کند این است که در هر واکنش MS-MLPA دو نمونه ایجاد می شود:

a. نمونه تجزیه نشده جهت تعیین تعداد کپی

b. نمونه تجزیه شده جهت تشخیص متیلاسیون. فرایند MS-MLPA پنج مرحله دارد:‌

پروتکل MS-MLPA

۱.دناتوراسیون DNA و هیبریداسیون پروب‌های MLPA

۲.واکنش ligation و تجزیه توسط آنزیم محدودکننده

۳.واکنش PCR

۴.تفکیک محصولات تکثیری توسط الکتروفورز مویرگی

۵.آنالیز داده‌ها

پروب‌های MS-MLPA که برای واکنش‌های تشخیص متیلاسیون استفاده می شوند، به سایر پروب‌های MLPA شبیه هستند ، اما توالی هدف آن‌ها دارای جایگاه تشخیص اندونوکلئاز حساس به متیلاسیون HhaI می‌باشد. بعد از هیبریداسیون، واکنش به دو لوله جداگانه تقسیم می‌شود. در یکی از لوله‌ها، واکنش MLPA استاندارد انجام گرفته و اطلاعاتی را در مورد تغییرات در تعداد کپی‌ها به ما می دهد. در لوله دیگر، انکوباسیون با اندونوکلئاز HhaI همزمان با ligation پروب‌های هیبریدشده انجام می‌شود. هیبرید تشکیل‌شده بین پروب‌ها و نمونه DNA غیرمتیله به وسیله ی آنزیم محدودکننده HhaI تجزیه می‌ شود. پروب‌های تجزیه شده توسط PCR به صورت نمایی تکثیر نمی شوند و به همین دلیل در زمان الکتروفورز مویرگی سیگنالی از آن‌ها به دست نخواهد آمد. در مقابل، درصورتی که نمونه DNA متیله باشد، هیبرید‌های پروب-DNA به تجزیه به وسیله ی HhaI مقاوم اند و پروب‌های ligate شده، بعد از الکتروفورز پیک ایجاد خواهند کرد.

تکنیک MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

واریانت های تکنیک (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) MLPA