✍ پروتکل/دستورالعمل کشت با قدرت تفکیک بالا (HR)

برای بدست آوردن کروموزومهای بلند تر و با شکل واضح تر ، سیکل سلولی را در مرحله S با یک مهارکننده مانند methotrexate( MTX), flurodeoxyuridine (FdU) و یا fdU همراه با bromodeoxyuridne (BrdU)  متوقف کنید. حتی در مواردی هم  از تایمیدین استفاده کنید و پس از ۱۷_۱۴ ساعت مهارکننده را از شستشو  برداشته و پس از ۷_۴ ساعت هاروست را انجام دهید. شروع هاروست را با اضافه کردن کلسمید انجام دهید، و مدت زمان انکوبه در ۳۷ درجه ۲۰_۱۵ دقیقه باشد. مشکلات این روش کاهش تعداد متافاز به علت اثر سمی بلوک کننده ها می باشد.

دستورالعمل/پروتکل HR با استفاده از MTX:

مواد مورد نیاز:

محیط کشت کامل

محیط کشتی که حاوی ۵درصد سرم

محلول MTX

محلول تایمیدین

محلول کلسمید

دستورالعمل/روش کار

۱-در مرحله اول نمونه مغز استخوان را کشت دهید.

۲-لوله ها را به مدت ۳ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید. در واقع این کار باعث آماده شدن سلول ها برای تاثیر MTX می شود.

۳-در ادامه مقدار MTX0.1ml  به لوله ها اضافه کنید و بعد آنها را در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۷_۱۴ ساعت انکوبه کنید.

۴- لوله ها را به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ، و سپس ۵ml محیط کشت (حاوی ۵ درصد سرم) به منظور شستشوی سلول ها اضافه کنید، و محتوی لوله ها را خوب مخلوط کنید.

۵- به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ نمائید.

۶-لایه رویی را بردارید، رسوب را خوب مخلوط کنید، و مجددا ۵ml محیط کشت کم سرم، اضافه نموده و محتوی لوله را خوب مخلوط کنید.

۷-مقدار۰.۱ml  تایمیدین به لوله اضافه کنید، و به مدت ۷_۵ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه نمائید.

۸-دراین مرحله صد میکرو لیتر (۱۰۰µl) کلسمید با غلظت  ۱۰µg/mlبه لوله اضافه کنید، و به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه نمائید.

۹-در مرحله آخر طبق پروتکل خون ، هاروست کنید.

دستورالعمل/پروتکل HR با استفاده از( FdU) Fluorodeoxyyuridin

مواد مورد نیاز

محیط کشت کامل BM

محلول فلورودی اکسی یوردیدن (FdU)

محلول یوریدین

محلول کلسمید

محلول تایمیدین

 نکته مهم :انتخاب نوع کشت بستگی به لوسمی دارد، به عنوان مثال در لوسمی پرومیلوستیک حاد(APML) جابجائی کروموزومی بین کروموزوم های ۱۷/۱۵ فقط در کشت های ۲۴ ساعته و یا طولانی تر مشاهده می شود، و کشت مستقیم (direct) لازم نیست. همچنین برای بیماران مبتلا به لنفوم، بایستی از میتوژن مناسبی استفاده نمود.

پروتکل/دستورالعمل /HR  مغز استخوان

۱-طبق معمول کشت دهید

۲-ساعت ۳ بعد از ظهر، مقدار۵۰µl یوریدین و FdU 50µl اضافه کنید، خوب مخلوط کنید و داخل انکوباتور قرار دهید.

۳-سپس ۱۷ ساعت بعد، یعنی ۸ صبح روز بعد، مقدار۱۰۰µl  تایمیدین مخصوص BM اضافه و داخل انکباتور قرار دهید. و بالاخره ۴ ساعت و ۴۵ دقیقه بعد، مقدار ۱۰۰µl کلسمید اضافه، و ۱۵ دقیقه بعد، هاروست کنید.

پروتکل/دستورالعمل استفاده از دی اکسی سایتیدین

تمامی مراحل شبیه به قبل می باشد. با این تفاوت که روز قبل از هاروست، ساعت ۱۴:۳۰ به میزان ۱۰۰ میکرو لیتر دی اکسی  تایمیدین به نمونه ها اصافه کنید،  و روز هاروست، ساعت ۸ صبح، ۱۰۰ میکرولیتر دی اکسی سایتیدین به نمونه ها اضافه شود و سپس ۵ ساعت بعد، هاروست آغاز می شود ( نحوه هاروست هیچگونه  تغییری ندارد).

تکنیک کاریوتایپ – نمونه مغز استخوان روش کار/پروتکل