✍ شناسایی فاژهای نوترکیب و راه های تشخیص پلاک های نوترکیب .

۱- دخول غیر فعال کننده ژن LacZ’ در وکتور فاژی: همه ی وکتور های کلونینگ M13 ، همانند تعدادی از وکتور های لامبدا دارای ژن LacZ’ می باشند. ورود DNA جدید به این ژن ، مشابه وکتور پلاسمیدی PUC8 ساخت آنزیم بتا گالاکتوزیداز را غیر فعال خواهد کرد. سلول های نوترکیب با کشت روی محیط آگار حاوی X-gal تشخیص داده می شوند که در این محیط ، پلاک های طبیعی آبی رنگ و پلاک های نوترکیب شفاف هستند.

۲- دخول غیر فعال کننده ژن  cI فاژ لامبدا: بعضی از وکتور های کلونینگ لامبدا دارای محل های شناسایی منحصر به فردی در ژن cI هستند. دخول غیر فعال کننده این ژن ، باعث تغییر در ظاهر پلاک می شود . پلاک های طبیعی دارای نمای مات هستند در حالی که پلاک های نوترکیب، که در آن ژن cI تخریب شده است، شفاف هستند. یک فرد با تجربه به راحتی قادر است این دو را از هم تمایز دهد.

۳- انتخاب با استفاده از فنوتیپ Spi: به طور طبیعی فاژ لامبدا قادر به آلوده کردن سلول های E.coli که از قبل DNA فاژ P2 در ژنومشان اینتگره شده است نمی باشد . بنابراین، به آن فاژ لامبدا Spi⁺  (حساس به مهار توسط پروفاژ P2 ) می گویند. تعدادی از وکتور های لامبدا به شکلی طراحی شده اند که ورود DNA جدید در آن ها باعث تغییر شکل Spi⁺  به Spi^–  می شود و در نتیجه ، فاژهای نوترکیب قادر به آلوده کردن سلول های حامل پروفاژ P2 خواهند بود . در نتیجه اگر برای کلونینگ توسط این وکتورها از این سلول های میزبان استفاده شود ، فقط سلول های نوترکیب Spi^–  خواهند بود و فقط آن ها تشکیل پلاک می دهند.

۴-انتخاب بر اساس اندازه ژنوم لامبدا: سیستم بسته بندی لامبدا که ذرات فاژ لامبدای بالغ را سرهم بندی می کنند ، تنها مولکول های DNA با اندازه بین ۳۷ تا ۵۲ کیلو باز بسته بندی نمی شوند . بسیاری از وکتورهای لامبدا که با حذف بخش بزرگی از مولکول DNA لامبدا ساخته شده اند اندازه ی کمتر از ۳۷ Kb دارند . این مولکول های DNA زمانی در ذرات کامل فاژ بسته بندی می شوند که بعد از ورود  یک قطعه DNA اضافی طول آن ها به ۳۷ کیلو باز یا بیشتر برسد . بنابراین تنها فاژهای نوترکیب قادر به همانندسازی خواهند بود.

 وارد کردن DNA به سلول های غیر باکتریایی است

در صورت استفاده از مخمرها ،قارچ ها، سلول های گیاهی و جانوری به عنوان میزبان نیاز به روش های جدید برای وارد کردن DNA به این سلول ها خواهیم داشت . به بیان دقیق تر در این سلول ها ترانسفورماسیون به معنای جذب DNA توسط سلول انجام نمی شود.ترانسفورماسیون فقط برای باکتری ها به کار می رود اگرچه زیست شناسان مولکولی در طول زمان این موضوع را فراموش کرده اند و امروز ترانسفرم کردن برای جذب DNA توسط هر موجودی استفاده می شود.

به طور کلی غوطه ور کردن سلول ها در محلول نمکی برای تعدادی از گونه های باکتریایی موثر خواهد بود، اما تیمار کردن با کلرید لیتیم یا استات لیتیم ، برداشت DNA توسط سلول های مخمری  را افزایش می دهد و این روش به فراوانی برای ترانسفورم کردن ساکارومایسس سروزیه مورد استفاده قرار می گیرد . با همه این ها ، برای موجودات پیشرفته تر روش های پیچیده تری مورد نیاز است.

ترانسفورم کردن سلول های خاص :  در مورد بیشتر موجودات زنده دیواره سلولی بزرگ ترین سد برای برداشت DNA است . سلول های کشت شده جانوری که به طور معمول دیواره سلولی ندارند به راحتی ترانسفورم می شوند ، به خصوص اگر DNA با استفاده از فسفات کلسیم روی سطح سلول ها رسوب داده شود. یا درون لیپوزوم های ادغام شونده با غشای سلولی قرار گرفته باشند . برای سلول های دیگر، راه حل عمده معمولا حذف دیواره سلولی است. آنزیم هایی برای تخریب دیواره سلولی مخمرها، قارچ ها و سلول های گیاهی در دسترس است و در شرایط مناسب می توان پروتوپلاست های کاملی را از آن ها به دست آورد که به طور معمول پروتوپلاست ها DNA را به راحتی برداشت می کنند . ترانسفورم کردن را می توان با روش ویژه ای مانند الکتروپوریشن تحریک نمود که در این روش سلول ها با یک ضربان الکتریکی کوتاه مورد هدف قرار می گیرند تا تشکیل منافذ موقتی در غشا سلولی القا شده و مولکول های DNA بتواند وارد سلول شوند . بعد از ترانسفورم کردن، پروتوپلاست ها را برای حذف آنزیم های تخریب گر می شویند و دیواره سلولی خود به خود دوباره تشکیل می گردد.

برخلاف سیستم های ترانسفورماسیون که تا به حال شرح داده شد، دو روش فیزیکی دیگر برای وارد کردن DNA به سلول ها وجود دارد. اولین روش ریز تزریقی است که با استفاده از یک پیپت بسیار ظریف مولکول های DNA به طور مستقیم به درون سلول مورد نظر تزریق می شود. این روش ابتدا برای سلول جانوری انجام شد ولی بعدها برای سلول های گیاهی هم موفقیت آمیز بود. روش دوم شامل بمباران کردن سلول ها با ریز پرتابه ها با سرعت بالا است که به طور معمول از ذرات طلا و یا تنگستن پوشیده با DNA ساخته می شوند. این ریز پرتاب ها از یک تفنگ ذره ای به طرف سلول ها نشانه گیری می شوند . این روش غیرمعمول که روش بیولیستیک نام دارد برای انواع مختلفی از سلول ها استفاده شده است.

تکنیک کلونینگ ژن (Gene cloning technique)