تشخیص هویت سلول ها با روش ایمونوفلورسانس
تکنیک ایمونوفلورسانس یکی از تکنیک هایی است که کاربرد زیادی در شناسایی مولکول های سطحی سلول ها دارد. از روش ایمونوفلورسانس برای یافتن یک آنتی ژن یا آنتی بادی و یا تعیین موقعیت آن ها در یک برش بافتی یا سلولی استفاده می شود.
در این تکنیک مولکول نشانگر مواد فلورسنت مثل فلورسئین ایزوتیوسیانات یا رودامین و… هستند که به طور شیمیایی به آنتی بادی موردنظر متصل شدند. آنتی بادی های اختصاصی گران قیمت هستند برای همین در این آزمون ها برای صرفه جویی در مصرف آنتی بادی ها از لام های مخصوص که دارای حفره های کاذب کوچک هستند استفاده می شود.
در صورتی که امکان دسترسی به این لام ها وجود نداشته باشد، می توان با استفاده از ماژیک های ضد آب حفره ی کاذبی روی لام ایجاد کرد و سوسپانسیون سلولی با رقت مناسب را روی آن اضافه کرد. این سلول ها باید بطور یکنواخت روی لام پخش شوند و سلول ها روی همدیگر قرار نگیرند. لام ها بعد از خشک شدن، با متانول یا هر فیکساتور مناسب دیگری ثابت شده و آماده ی رنگ آمیزی می شوند.
دستورالعمل/ روش کار ایمونوفلورسانس
آزمون ایمونوفلورسانس به دو روش مستقیم و غیرمستقیم قابل انجام است.
ایمونوفلورسانس به روش مستقیم:
آنتی بادی های اختصاصی شاخص مورد نظر با مواد فلورسنت نشان دار شده و بعد از تهیه ی رقت لازم مستقیما روی سلول ها اضافه می شوند. بعد از تمام شدن زمان انکوباسیون، لام ها در بافر حاوی اوانس بلو شسته شده و بعد از خشک شدن بر روی آنها محلول مانت اضافه می شود و لام ها با میکروسکوپ ایمونوفلورسنت مطالعه می شوند.
معمولا برای شستشوی لام ها از بافر فسفات با pH بین ۷.۲ تا ۷.۴ استفاده می شود. بدین ترتیب که ابتدا معرف روی لام ها با بافر مربوطه شستشو داده می شود و بعد لام ها در داخل جارهای مخصوص شستشوی لام در داخل بافر غوطه ور می شوند و چند دقیقه در داخل جار تکان داده می شوند تا مواد اضافی که بطور غیراختصاصی به لام چسبیده شسته شده و از محیط عمل خارج شوند.
برای ایجاد کنتراست بیشتر، بهتر است چند قطره اوانس بلو هم به بافر اضافه کرد تا زمینه ی سلول ها قرمز تا ارغوانی شود و نواحی فلورسنت شده بهتر قابل تشخیص و تمایز بشوند.
ایمونوفلورسانس به روش غیر مستقیم:
که حساسیت بیشتری دارد، ابتدا آنتی بادی اختصاصی شاخص مورد نظر بدون کونژوگه شدن با مواد فلورسنت روی سلول ها افروده می شود و بعد از اتمام زمان انکوباسیون لام ها شسته شده و آنتی بادی دوم که در واقع علیه شاخص های آنتی ژنیک آنتی بادی اول بوده و با مواد فلورسنت کونژوگه شده اضافه می شود.
بعد از اتمام زمان انکوباسیون، مثل روش مستقیم، لام ها در بافری که حاوی رنگ اوانس بلو است شسته شده و بعد از خشک شدن روی آن ها محلول مانت اضافه شده و با میکروسکوپ ایمونوفلورسنت بررسی می شوند.
با توجه به اینکه کونژوگه کردن آنتی بادی ها باعث از دست رفتن مقداری از آنتی بادی می شود، معمولا از روش غیرمستقیم که نیاز به کونژوگه کردن کردن آنتی بادی اولیه ندارد استفاده می شود. آنتی بادی ثانویه علیه شاخص های آنتی ژنیکی آنتی بادی اولیه بوده و بصورت تجاری وجود دارد و خیلی ارزان تر از آنتی بادی کونژوگه اختصاصی شاخص خاص است. روش غیر مستقیم با توجه به حساسیت بیشتر و مقرون به صرفه بودن رایج تر است.
برای یادگیری تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه کشت سلول
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید.
بیشتر بخوانید: