✍ کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست

در حال حاضر پروژه های بسیاری در سرتاسر جهان توسط شرکت های بیوتکنولوژی با هدف بکارگیری روش های اضافه کردن یا حذف ژن برای بهبود محصولات کشاورزی، انجام می شود. در مطلب مربوط به کلونینگ ژن ها و آنالیز DNAدر کشاورزی بخش اول چند نمونه از این پروژه ها را بررسی کردیم از جمله، روش اضافه کردن ژن در مهندسی ژنتیک گیاهان، گیاهانی که آفت‌کش موردنیاز خود را می‌سازند، دلتا اندوتوکسین باسیلوس تورینژنسیس، کلونینگ ژن ها دلتا اندوتوکسین در ذرت.  در ادامه می پردازیم به کلونینگ ژن های دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست

یکی از مسائل مطرح شده در مورد غلات این بود که شاید ژن های کلون شده در گیاهان اصلی به علف های هرز منتقل شوند. از نظر بیولوژیکی این مسئله غیر ممکن است زیرا گرده ای که توسط گیاه اصلی تولید می شود فقط قادر است تخمک همان گونه را بارور سازد، بنابراین انتقال یک ژن از محصول اصلی به گیاه هرز غیر ممکن است. با این حال، یک روش که می تواند چنین مسئله ای را کاملا غیر ممکن بسازد، قرار دادن ژن درون ژنوم کلروپلاست به جای هسته است. به همین خاطر، از آنجا که گرده ی گیاهان دارای کلروپلاست نیستند، ژن مورد نظر قادر به جابجایی از گیاه اصلی به علف هرز نمی باشد. سنتز پروتئین دلتا اندوتوکسین در کلروپلاست های تراریخته، در یک آزمایش تجربی در گیاه تنباکو به اثبات رسیده است. برای این کار، از ژن (a2) Cry IIA استفاده کردند که پروتئین حاصل از آن طیف سمیت وسیع تری نسبت به توکسین های Cry IA  دارد به طوری که لارو مگس های دو بال را هم علاوه بر پروانه ها می کشد. در باکتری باسیلوس تورینژنسیس ژن (a2) Cry IIA سومین ژن یک اپرون کوچک است. دو ژن ابتدایی اپرون، پروتئین هایی را کد می کنند که به تا خوردن و پردازش سم کمک می کنند. یک مزیت استفاده از کلروپلاست به عنوان جایگاهی برای ژن نوترکیب این است که سیستم بیان ژن کلروپلاست هم همانند باکتری است(زیرا کلرو پلاست ها زمانی خود پروکاریوت های زنده ی مستقلی بودند) و قادر به بیان هر سه ژن در یک اپرون خواهد بود؛ اما اگر ژنی را بخواهیم در ژنوم هسته ی گیاه یا حیوان وارد کنیم، هر ژن باید به طور جدا با پروموتر و سیگنال های بیانی مخصوص به خود کلون شود که این مسئله بیان دو یا چند ژن در یک زمان را بسیار مشکل می سازد.

اپرون (a2) Cry IIA به ژن مقاومت کانامایسین به همراه توالی های DNA  کلروپلاست مجاور متصل شد و سپس قطعه ی ساخته شده به کمک روش بیولیستیک وارد سلول های برگ گیاه تنباکو شد. همچنین دخول به درون ژن کلروپلاست توسط روش انتخابی مقاومت به کانامایسین تضمین شد؛ به این صورت که قطعاتی از برگ گیاه را درون آگار حاوی کانامایسین حدود ۱۳ هفته قرار دادند. جوانه ای که از قطعات برگ بیرون زده بود را در محیطی دیگر وارد کردند که ریشه زایی را تحریک می کرد و بدین ترتیب گیاه کامل بدست آمد. میزان پروتئین (a2) Cry IIA که تولید شده بود، بسیار قابل توجه بوده به طوری که حدود ۴۵ درصد از میزان کل پروتئین محلول را تشکیل می داد که این مقدار بیشتر از روش های کلونینگ قبلی بود. این بیان بالای پروتئین به احتمال خیلی زیاد به خاطر تعداد بالای کپی های ژن (زیرا تعداد ژنوم کلروپلاست در سلول بسیار زیاد است در حالی که فقط دو عدد از کپی های ژنوم هسته وجود دارد) و حضور دو ژن کمک کننده ی دیگر اپرون در کلروپلاست است. همان طور که پیش بینی می شد گیاه مورد نظر در برابر لاروهای حساس بسیار سمی شده بود. ۵ روز بعد از آلوده کردن گیاهان با حشرات تمام کرم های غوزه پنبه و کرم مسلح چغندر کشته شده بودند و تنها آسیب بسیار کمی روی برگ گیاهانی که با کرم مسلح چغندر آلوده شده بودند دیده می شد که آن ها هم به خاطر مقاومت بالای طبیعی این کرم به دلتا اندوتوکسین است. همچنین میزان بالای توکسین در بافت برگ ها اثری روی خود گیاهان نگذاشته بود، زیرا گیاهان تنباکوی مهندسی شده با گیاهان طبیعی از نظر فاکتور هایی مثل میزان رشد، مقدار کلروفیل و سطح فتوسنتز غیر قابل تمایز بودند. تلاش ها برای انجام همچنین روشی برای ذرت، پنبه و سایر محصولات کشاورزی مفید، به دلیل مشکلاتی که در ترانسفورماسیون کلروپلاست این گیاهان وجود دارد، با موانعی همراه بوده است.

مبارزه با حشرات مقاوم به محصولات تولید کننده ی دلتا اندوتوکسین

مدت طولانیست که مشخص شده است، محصولاتی که دلتا اندوتوکسین می سازند پس از مدتی بی اثر می شوند، زیرا حشراتی که از این محصولات تغذیه می کنند پس از مدتی به این توکسین مقاوم می شوند. این امر نتیجه ی طبیعی در معرض قرار گرفتن این حشرات با مقدار زیادی از توکسین است و بدین ترتیب بعد از چند سال دیگر گیاهان مهندسی شده نسبت به گیاهان معمولی برتری نداشتند. استراتژی های زیادی برای جلوگیری از ایجاد مقاومت در حشرات پیشنهاد شده است. یکی از اولین استراتژی ها که پیشنهاد شد، ایجاد محصولاتی بود که در ۲ ژن  Cry II و Cry I را بیان کنند. با این منطق که چون این دو توکسین با هم متفاوت هستند، ایجاد مقاومت علیه هر دو سم در یک جمعیت حشرات بسیار غیر متحمل خواهد بود. یک راه دیگر می تواند این باشد که فرایند تولید سم را طوری تغییر دهیم که سنتز آن فقط در بخش نیازمند به محافظت در گیاه انجام شود. راه کار سوم این است که گیاهان دستکاری شده و گیاهان طبیعی را باهم در یک زمین زراعی کشت دهیم، چرا که حشرات می توانند از بعضی از گیاهان بدون در معرض قرار گرفتن با توکسین، تغذیه کنند.

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی – بخش اول

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی – بخش دوم

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی – بخش سوم

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی – بخش چهارم

کلونینگ ژن ها و آنالیز DNA در کشاورزی – بخش پنجم