✍ انتقال ژن به داخل کلروپلاست و کلونینگ ژن ها بدون وکتور چگونه انجام می شود؟

در سال ۱۹۸۴ که برای اولین بار انتقال مستقیم ژن انجام شد، مشاهده شد که اگرچه پلاسمید مارپیچ مضاعف باکتریایی در سلول گیاهی قادر به همانندسازی از روی خودش نیست ولی می تواند با استفاده از نوترکیبی به یکی از کروموزوم های گیاهی وارد شود. با وجود اینکه فرایند نوترکیبی به صورت جزئی شناخته شده است ولی به احتمال زیاد متمایز و متفاوت از فرایند های دخیل در ورود T-DNA است. همچنین با روند دخول وکتورهای مخمری در کروموزوم نیز متفاوت است، زیرا در این روش نیازی به قطعه مشابه بین پلاسمید باکتریایی و DNA گیاه نمی باشد. در واقع به نظر می رسد که الحاق به صورت اتفاقی و در هر موقعیت از کروموزوم های گیاه صورت می گیرد. چنانچه انتقال مستقیم ژن با ابر مارپیچ پلاسمیدی انجام گیرد، در صورت امکان از یک پلاسمید باکتریایی ساده دارای یک مارکر انتخابگر مناسب (برای مثال ژن مقاوم به کانامایسین ) و ژن کلون شونده استفاده می شود.

بیولیستیک روشی است که به طور فراوان جهت ورود DNA پلاسمیدی به داخل جنین های گیاهی مورد استفاده قرار می گیرد، همانند آنچه در مورد ترانسفورماسیون آگروباکتریوم توصیف شد، باززایی می شوند; اما اگر گونه های که تحت دست ورزی قرار گرفته اند را بتوان از پروتوپلاست ها یا سلول های منفرد باززایی کرد، استفاده از روش های دیگری که موثر تر از بیولیستیک هستند نیز امکان پذیر خواهد بود. معلق ساختن پروتوپلاست ها در یک محلول ویسکوز از پلی اتیلن گلیکول (ترکیبی پلی مریک با بار منفی) یکی از روش هاست که تصور بر این است این ترکیب سبب رسوب DNA بر سطح پروتوپلاست ها و القای جذب آن به وسیله اندوسیتوز می شود. همچنین از الکتروپوریشن در بعضی مواقع جهت افزایش ترانسفورماسیون استفاده می شود. بعد از تیمار کردن، پروتوپلاست ها را چند روزی در محلول کمک کننده به ساخت مجدد دیواره سلولی قرار می دهند. سپس سلول ها را روی محیط انتخابی پخش می کنند تا سلول های ترانسفورم شده شناسایی شوند و کشت های کالوس برای رشد گیاهان کاملی تهیه گردند.

انتقال ژن به داخل کلروپلاست

اگر از روش بیولیستیک برای ورود DNA به داخل جنین گیاه استفاده شود، ممکن است بعضی ذرات به داخل یک یا تعدادی از کلروپلاست های داخل سلول نفوذ کنند.کلروپلاست ها با ژنوم خاص خود که اندازه ی خیلی کوچک نسبت به مولکول های DNA موجود در هسته دارند مشخص می شوند و تحت شرایطی هدف ورود DNA  پلاسمیدی قرار می گیرند. بر خلاف ورود  DNA  به داخل کروموزوم های هسته ای، ورود به داخل ژنوم کلروپلاست بر حسب اتفاق انجام نخواهد شد. در عوض قطعه DNA ای که می خواهد کلون شود، بایستی دو توالی در طرفین خود داشته باشد که مشابه منطقه ای از ژنوم کلروپلاست است که DNA به آن وارد خواهد شد، به صورتی که ورود می تواند با نوترکیبی همولوگ اتفاق بیافتد. طول قطعات کناری بایستی ۵۰۰ جفت باز یا بیشتر باشد. اگر پلاسمید وارد شده به سلول حاوی توالی های کناری باشد، سطح پایینی از ترانسفورماسیون کلروپلاست بعد از تحویل DNA القا شده با PEG امکان پذیر است.

از میان ده ها کلروپلاستی که سلول دارد احتمالا تنها یکی از هر سلول ترانسفورم می شود بنابراین DNA الحاق یافته بایستی مارکر انتخابگری مثل ژن مقاوم به کانامایسین را حمل کند و جنین های تیمار شده بایستی مدتی با آنتی بیوتیک مجاور شوند تا از تکثیر ژن های ترانسفورم شده در داخل سلول اطمینان حاصل شود. اگرچه ترانسفورم موفقیت آمیز ژن به کلروپلاست به سختی انجام می شود، اما این روش را می توان به عنوان رویکردی جانبی برای روش های سنتی تولید غلات اصلاح شده از نظر ژنتیکی به کار برد. با توجه به اینکه سلول دارای کلروپلاست زیادی است و تنها یک هسته دارد احتمالا ژن وارد شده به ژنوم هسته در سطح بالاتری بیان می شود.

وکتورهای کلونینگ در جانوران

در سال های اخیر تلاش قابل توجهی جهت توسعه وکتورهای کلونینگ ژن ها در سلول های جانوری صورت گرفته است. این وکتور ها در بیوتکنولوژی جهت سنتز پروتئین نوترکیب از ژن های کلون شده ای که به طرز صحیحی در E.coli یا مخمر بیان نمی شوند، مورد نیاز می باشند. از این وکتور ها برای انجام روش های کلونینگ در انسان به منظور اهدافی مانند ژن درمانی توسط زیست شناسان مولکولی بالینی در حال انجام است.

وکتورهای کلونینگ در حشرات

مگس سرکه یا دروزوفیلا ملانوگاستر، همچنان یکی از مهم ترین ارگانیسم های مورد استفاده توسط بیولوژیست ها است. به تازگی کشف ژن های انتخاب گر هومئوتیک در دروزوفیلا که ژن های کنترل کننده طرح کلی بدن در حشره می باشد و ارتباط بسیار نزدیکی با ژن های معادل در پستانداران دارند، منجر به استفاده از این حشره به عنوان مدلی برای مطالعه روند های تکاملی انسان شده است.

عنصر P  به عنوان وکتور کلونینگ در دروزوفیلا

کلونینگ در دروزوفیلا با ترانسپزونی که عنصر P نامیده می شود انجام می گیرد. ترانسپوزون ها که که در تمام انواع ارگانیسم ها معمول و متداول هستند، قطعات کوتاهی از DNA (معمولا کمتر از  ۱۰kb دارند) هستند که قادر به جابه جایی از یک محل به محل دیگر بر روی کروموزوم می باشند. عناصر P، که یکی از چندین نوع ترانسپوزون موجود در دروزوفیلا هستند، ۹/۲kb  طول دارند و حاوی ۳ ژن به همراه توالی های تکراری معکوس کوتاه در ۲ طرف می باشند. این ژن ها آنزیم ترانسپوزاز را کد می کنند که فرایند جابه جایی را انجام می دهد، و همچنین توالی های معکوس، محل های شناسایی را تشکیل می دهند که آنزیم را قادر می سازند که دو انتهای توالی ترانسپوزون الحاقی را شناسایی کند.

عناصر P می توانند بین کروموزوم ها یا پلاسمید حمل کننده عنصر P و یکی از کروموزوم های مگس جابجا شود. جابجایی قطعات بین پلاسمید کروموزوم عامل کلیدی در استفاده از عناصر P به عنوان وکتورهای کلونینگ است. این وکتور، پلاسمیدی است که حامل دو عنصر P می باشد که یکی از عناصر دارای جایگاه ورودی برای DNA ای ست که قرار است کلون شود، به طوری که الحاق DNA جدید به داخل عنصر P منجر به تخریب ژن آنزیم ترانسپوزاز می شود و بدین ترتیب باعث غیر فعال شدن این عنصر می گردد. اما عنصر P دوم که توسط پلاسمید حمل می شود، دارای نسخه سالم از ژن آنزیم ترانسپوزاز می باشد. با ورود ژن کلون شونده به داخل وکتور، DNA پلاسمیدی با ریز تزریقی به جنین های مگس سرکه منتقل می شود.

کلونینگ در پستانداران

کلونینگ ژن در پستانداران به سه دلیل زیر انجام می گیرد:

1. جهت انجام ناک اوت ژن که تکنیک مهمی جهت تعیین عملکرد یک ژن ناشناخته است که معمولا این آزمایشات بر روی موش انجام می شود.
2. جهت تولید پروتئین نوترکیب در کشت سلول های پستانداران و در تکنیک های مرتبط با داروسازی که شامل دستکاری ژنتیکی حیوانات اهلی است.
3. ژن درمانی که در این روش سلول های انسانی جهت درمان بیماری ها مورد دستکاری و مهندسی قرار می گیرند.

کلونینگ ژن ها بدون وکتور

یکی از دلایلی که چرا وکتورهای ویروسی در کلونینگ ژن ها در پستانداران کاربرد گسترده ای ندارند این است که در اوایل دهه ۱۹۹۰ کشف شد که موثرترین روش انتقال ژن های جدید به سلول های پستانداران روش ریز تزریقی می باشد. اگرچه این روش مشکل است، اما ریز تزریقی پلاسمید های باکتریایی یا نسخه های DNA خطی ژن ها به هسته سلول های پستانداران منجر به ورود DNA به کروموزوم ها می شود که گاهی به صورت نسخه های تکراری با آرایش سر به دم قرار می گیرند.

ریز تزریقی DNA اساس خلقت جانوران ترانس ژنیک (جانوری که حاوی ژن کلون شده در همه سلول هایش می باشد) است. موش ترانس ژنیک را با استفاده از ریز تزریقی به یک تخم بارور و کاشته شدن آن در رحم مادر می توان تولید کرد. روش دیگر، استفاده از یک سلول بنیادی جنینی است . این سلول ها از جنین ابتدایی به دست می آیند و بر خلاف بیشتر سلول های پستانداران، قابلیت تبدیل به تمامی رده های سلولی را دارند (توتی پوتنت) بدین معنی که الگوی تکاملی آن ها از قبل ایجاد نشده و سلول های حاصل از آن ها قادرند چندین ساختار متفاوت در موش بالغ را تشکیل دهند.

تکنیک کلونینگ ژن (Gene cloning technique)