✍ پروتکل/روش کار کشت CVS

تمیز کردن نمونه

نمونه های CVS را که تهیه می کنند اغلب مواقع با لخته خون و مواد جفتی آلوده هستند، بنابراین لازم است که نمونه کاملا تمیز شوند، و پیش از کشت و پیش از آنکه مواد چسبیده adherent  برداشته شوند. این خصوصا برای نمونه هایی که به آنالیز مولکولی نیاز دارند، مهم است، چون DNA مادری بر روی نتیجه اثر خواهد کرد. CVS یک ظاهر پفی شکل و frondyمشخص دارد، ولی جفت مادری تمایز نشده و ظاهر fluffy یا اسفنجی دارد. جفت مادر بر کشت کوتاه مدت اثری ندارد، اما پتانسیل رشد خوبی در کشت طولانی مدت دارد که اغلب بافت جنین را از پروسه رشد خارج می کند. برای تمیز کردن نمونه، Villi را در داخل یک پتری دیش که حاوی محیط  شستشو است بریزید، بخصوص برای نمونه هایی که آغشته به خون هستند، روش شستشو را دو تا سه بار تکرار کنید. در زیر یک میکروسکوپ dissecting با یک جفت سر سوزن نازک کار کنید، هر لخته خون یا جفت چسبنده  را بردارید Villi تمیز را به قسمت های مختلفی برای کشت های بلند مدت و کوتاه مدت، بر طبق اندازه نمونه و تعداد تست هایی که از نمونه مورد نظر است جدا کنید.

کشت کوتاه مدت

این روش با توقف سلول ها در متافاز برای لایه سیتوتروفوبلاست فعّال، از نظر میتوزی به کار می رود. این روش چند ساعت یا  ۴۸-۲۴ ساعت پس از نمونه گیری است. بنابراین اصطلاحات مختلفی برای آن به کار می رود مثل: کشت مستقیم، ovetnight و کشت کوتاه مدت.

 

پروتکل/دستورالعمل – کشت overnight پرزهای جفتی و هاروست

لوازم و محلول ها:

۱- هود لامینار  class2

۲- سیلندر گاز %۵ CO2 در هوا یا انکوباتور، سه گازه یا CO2 در ۳۷ درجه سانتی گراد

۳-لوله های لیتون (لوله های یک طرف تخت)

۴- پیپت پلاستیکی ۱ml

۵- پیپت پاستور، پلاستیکی ۱ml

۶- پیپت پاستور شیشه ای  ۱۵۰ml

۷- محیط کلسمید/ chang (غلظت نهایی  ۱µg/mlکلسمید در محیطchang)

۸- محلول سدیم سیترات %۱

۹- فیکساتیو: متانول _اسید استیک با نسبت ۳:۱

۱۰- محیط chang کامل

 دستورالعمل/روش کار:

۱- دو یا سه تکه کوچک پرز را انتخاب کنید و در یک لوله کشت در۱ml محیط chang قراردهید.

۲- لوله را با   %۵ CO2 گاز دهید و بعد درب لوله را محکم یا شل کنید و در انکوباتور گاز دار به مدت یک شب در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.

۳- صبح روز بعد ۰.۱ میلی لیتر مخلوط colcemid / chang  را اضافه کنید، و به مدت ۹۰ دقیقه دوباره انکوبه کنید.

۴-محیط را خارج کنید و ۱ml محلول هایپوتونیک سدیم سیترات ۱% به مدت ۱۵ دقیقه اضافه کنید.

۵- محلول هایپوتونیک را با استفاده از یک پیپت پاستور شیشه ای برداشته و فیکساتیو اضافه نمایید.

۶-فیکساتیو را با استفاده از یک پیپت پاستور شیشه ای تعویض کرده و در آن را در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه قرار می دهیم.

این روش همچنین می تواند برای هاروست مستقیم با اضافه کردن کلسمید بدون انکوباسیون overnight  به کار رود.

 

پروتکل/دستورالعمل آماده کردن کروموزوم برای کشت کوتاه مدت پرزهای جفتی:

لوازم و محلول ها:

۱-هات پلیت (Hotplate) 45درجه سانتی گراد

۲- اسلایدهای میکروسکوپ ۲۶×۷۶ میلی متری

۳- پتری دیش پلاستیکی ۳۵mm

۴- پیپت پاستور شیشه ای  ۱۵۰mm

۵- میکروسکوپ فاز کنتراست

۶- محلول اسیداستیک %۶۰

۷- الکل متیله شده  spirit 70%

دستورالعمل/روش کار:

۱- تعداد ۴-۶  اسلاید میکروسکوپی تمیز را بر روی hotplate با دمای ۴۵ درجه سانتی گراد قرار دهید.

۲- پرزها را از فیکساتیو استخراج و در یک پتری دیش ۳۵mm قرار دهید.

۳- پرز را در لبه پتری دیش جمع کنید و  فیکساتیو اضافی را بردارید.

۴- دیش را به لبه قرار داده و سپس ۵-۳ قطره اسید استیک %۶۰ روی آن بریزید و به مدت ده دقیقه بگذارید بماند تا جدا شود (dissociate).

۵- پس از ده دقیقه با استفاده از یک پیپت پاستور شیشه ای، مقدار کمی از سوسپانسیون سلولی را برداشته و مراقب باشید که تکه های پرز را بر ندارید.

۶- قطره را روی یکی از اسلایدها قرار دهید و پس از چند ثانیه به آهستگی برداشت کنید.

۷- این پروسه را با قرار دادن ۵-۴ قطره روی اسلایدها ادامه دهید.

۸- با میکروسکوپ فاز کنتراست، برای وجود سلول و گستره های متافازی بررسی کنید، و پروسه را بر روی بقیه اسلایدها نیز تکرار کنید. (اگر گستره متافازی نداشتید، به مدت ۵ دقیقه سوسپانسیون را نگه دارید).

 

دستورالعمل ها/روش های مختلفی برای کشت کوتاه مدت وجود دارد.

 پروتکل /دستورالعمل کشت دراز مدت

جدا کردن آنزیمی پرزهای جفتی برای کشت دراز مدت

مواد و وسایل:

۱- هود میکروبیولوژی class-2

۲- انکوباتور، سه گازه یا CO2 دار ۳۷ درجه سانتی گراد

۳- سیلندر گاز CO2 5% در هوا

۴- لوله سانتریفوژ ته مخروطی ۱۰ml

۵- پیپت پاستور شیشه ای ۱۵۰mm

۶- لامل ۲۲×۲۲ میلی متری

۷- پتری دیش پلاستیکی۳۵mm

۸- فورسپس نازک (برای هماهنگی coverslips لامل)

۹- میکروسکوپ inverted

۱۰- کلاژناز ۵۰۰µ/ml (sigma)Type 1A در HBSS

۱۱-کلاژناز ۱۶۵µ/ml (sigma)Type 1A در HBSS

۱۲- محیط chang B را کامل کنید.

دستورالعمل/روش کار

۱-پرزهای تمیز شده را در یک لوله سانتریفوژ قرار داده و ۱ml محلول کلاژناز از قبل گرم شده  در ۳۷ درجه سانتی گراد (۵۰۰µl/ml) را به آن اضافه کنید.

۲- در یک بن ماری شیکر دار ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۵ دقیقه و بدون شیکر ۳۰-۱۵ دقیقه انکوبه کنید.

۳- زمانی که سوسپانسیون ظاهر گرانولار دارد، بگذارید پرزها، ته نشین شوند، و سپس محلول رویی را با یک پیپت پاستور شیشه ای بردارید.

۴-در این مرحله ۱ml  کلاژناز رقیق شده (۱۶۵µ/ml) به لوله سانتریفوژی که شامل قسمت عمده پرزهای هضم شده است، اضافه کنید. اگر محیط با بافر بیکربنات به کار می برید، درب لوله را محکم کرده و overnight در ۴ درجه سانتی گراد قرار دهید، و یا با محیط با بافر HEPES ، درب لوله را محکم  کرده و overnight در۴ درجه سانتی گراد قرار دهید.

۵- پس از انکوباسیون overnight محلول رویی اضافه را بردارید، و به مدت ۳۰-۲۰ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد، لوله را به آرامی هر ۵ دقیقه یک بار، با نوک انگشتان ضربه بزنید.

۶- پس از ماکزیزمم ۳۰ دقیقه، یک پیپت پاستور شیشه ای پر از محیط، اضافه کنید و به مدت یک دقیقه پیپتاژ کنید(برای جدا شدن بیشتر پرزها)

۷-به مدت ۵ دقیقه در دور ۲۰۰g سانتریفوژ کنید.

۸- اضافی محیط را بردارید،pellet  باقیمانده را با ۱/۵ – ۱ میلی لیتر محیط chang مخلوط کنید، مقدار محیط بسته به سایز نمونه دارد.

۹-   ۰.۵ml از سوسپانسیون را داخل یک پتری دیش گذاشته و با یک میکروسکوپ invert بررسی نمائید.

۱۰- کشت های اضافه را با استفاده از یک سری رقیق کننده های اصلی، بر طبق سایز نمونه و دانسیته سلولی کشت اول، ست آپ کنید ( معمولا ۴ کشت).

۱۱- دیش ها را در ۳۷ درجه سانتیگراد، در یک انکوباتور CO2 یا سه گازه انکوبه نمائید.

پروتکل ها بر اساس setup هر آزمایشگاه تغییر می کنند.

 

تست Chorionic Villus Sampling – CVS (نمونه برداری از پرزهای کوریونی)

(Chorionic Villus Sampling) ماندگاری کشت، هاروست و تهیه کروموزوم