دستورالعمل انواع روش های رنگ آمیزی کپسول باکتری ها
رنگ آمیزی منفی جهت بررسی میکروسکوپی باکتری های کپسول دار کاربرد دارد. بسیاری از باکتری های مهم پزشکی از جمله استرپتوکوک پنومونیه، باسیلوس آنتراسیس و تعدادی از قارچ ها مثل کریپتوکوکوس نئوفورمنس یک پوشش خارجی بنام کپسول دارند. مشاهده کپسول در میکروارگانیسم بعنوان معیار تشخیصی و فاکتور بیماریزا دارای اهمیت زیادی است.
ساختمان کپسول باکتری:
کپسول باکتری از ترشح پلیمرهای خارج سلولی ساخته می شود. این لایه ترشح شده کاملا مشخص و متراکم است و اتصال سستی به سلول باکتری دارد. شبکه ای از فیبریل ها، اطراف باکتری را احاطه می کنند که به آن ها گلیکوکالیکس (Glycocalyx) گفته می شود. جنس کپسول معمولا پلی ساکارید است، ولی در برخی باکتری ها مانند؛ باسیلوس آنتراسیس کپسول باکتری ساختمان پلی پپتیدی ( D گلوتامیک) دارد.
تقریبا همه ی باکتری ها دارای حداقل مواد موسیلاژی ویژه در بیرونی ترین لایه خود می باشند. در برخی از حالات این لایه به حدی ژله ای است، که به صورت لایه ای با ضخامت یکنواخت اطراف سلول را احاطه می کند. برخی منابع بر این عقیده اند که کپسول باکتری هیچگونه وظیفه متابولیکی انجام نمی دهد و منابع دیگری کپسول را بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد مطرح می کنند. در برخی موارد کپسول فقط هنگامی ساخته می شود که قند خاصی بعنوان منبع کربن در محیط باکتری وجود داشته باشد. اندازه کپسول بستگی به محیط کشت باکتری دارد.همچنین باکتری های بیماریزا از کپسول بزرگتری نسبت به سایر باکتری های مولد کپسول برخوردارند.
کپسول باکتری از 3 جنبه حائز اهمیت است:
- عمل ضد بیگانه خواری
- اتصال به سطوح میزبان
- خاصیت آنتی ژنی و استفاده در گروه بندی باکتری ها
رنگ آمیزی کپسول روش نسبتا مشکلی است، زیرا مواد کپسولی محلول در آب بوده و ممکن است بوسیله شستشو از بین بروند. همچنین حرارت نیز باعث تخریب ساختار کپسول می شود. کپسول به حدی متراکم و محدود نیست که بتوان آن را در رنگ آمیزی عادی مشاهده کرد، لذا از رنگ آمیزی منفی برای مشاهده آن مشاهده می شود. در رنگ آمیزی منفی، زمینه با استفاده از رنگ های اسیدی رنگ می گیرد ولی کپسول باکتری بدون رنگ می ماند. در این روش کپسول بصورت هاله ای شفاف در اطراف باکتری و در یک زمینه تاریک مشاهده می شود.
برای یادگیری روش های رنگ آمیزی باکتری ها و سایر تکنیک های مورد نیاز برای آزمایشگاه میکروبیولوژی
از طریق لینک دوره های آموزشی تخصصی آزمایشگاه می توانید اقدام نمایید
رنگ آمیزی کپسول: روش آنتونی(Anthony)
در این روش از رنگ آمیزی کپسول، رنگ کریستال ویوله 1 درصد بعنوان رنگ اولیه می باشد که بر روی گسترش فیکس شده قرار می گیرد و مواد کپسولی را به رنگ تیره در می آورد. سپس سولفات مس 20 درصد برای شستشوی رنگ مورد استفاده قرار می گیرد، سولفات مس قادر به خارج کردن رنگ از سلول باکتری نمی باشد ولی بر خلاف باکتری، کپسول ماهیت غیر یونی داشته و بوسیله سولفات مس رنگ اضافی آن برداشته می شود. همچنین سولفات مس بعنوان رنگ متضاد عمل کرده و در کپسول باکتری نفوذ می کند و آن را به رنگ آبی روشن تا صورتی در می آورد.
- ابتدا یک لوپ از باکتری مورد آزمایش را بر سطح لام پخش می کنیم
- صبر می کنیم تا اسلاید در دمای آزمایشگاه خشک شود
- بدون فیکس کردن با حرارت، اسمیر را به مدت 5 تا 7 دقیقه با رنگ کریستال ویوله می پوشانیم
- اسلاید را به آرامی با سولفات مس می شوییم
- اسلاید را خشک می کنیم و با عدسی 100X و روغن مورد بررسی قرار می دهیم
رنگ آمیزی کپسول: روش گراهام – اوانس (Graham and Evans)
- ابتدا یک لوپ از باکتری مورد آزمایش رو با یک یا دو قطره جوهر هندی در یک انتهای لام مخلوط می کنیم
- با یک لام دیگر با زاویه 30 درجه روی لکه رنگی گذاشته و گسترش تهیه می کنیم
- صبر می کنیم گسترش در فضای آزمایشگاه خشک شود
- سپس به آرامی با آب مقطر می شوییم، بطوریکه باکتری ها از سطح لام پاک نشوند
- اسمیر را بوسیله کریستال ویوله به مدت یک دقیقه رنگ می کنیم
- سپس به آرامی با آب شستشو می دهیم
- اسمیر را یک تا 2 دقیقه بوسیله سافرانین رنگ می کنیم
- به آرامی با آب شستشو می دهیم
- در هوای آزمایشگاه خنک نموده و با عدسی 100X و روغن مشاهده می کنیم
رنگ آمیزی کپسول: رنگ آمیزی منفی یا رنگ آمیزی کپسول به روش مرکب چین(نیگروزین)
- یک یا دو لوپ از باکتری را در لبه کناری لام می گذاریم
- یک قطره معرف نیگروزین، جوهر هندی یا ائوزین به آن اضافه می کنیم، سپس با یک لام دیگر با زاویه 30 درجه روی لکه رنگی گذاشته و گسترش تهیه می کنیم
- صبر کرده تا گسترش در فضای آزمایشگاه خشک شود
- با عدسی کم در ابتدا اسمیر را بررسی می کنیم تا نواحی با ضخامت مناسب اسمیر پیدا شود
- با استفاده از روغن امرسیون و عدسی 100X اسلاید را مشاهده می کنیم
نکاتی که در حین رنگ آمیزی باید رعایت شود:
- در تمامی مراحل تهیه اسمیر و رنگ آمیزی کپسول به جای آب از محلول سولفات مس استفاده شود؛ زیرا کپسول باکتری از جنس پلی ساکارید بوده و در آب حل می شود.
- از هم زدن زیاد توسط لوپ خودداری کنیم؛ زیرا کپسول باکتری نسبتا شل بوده و ممکن است از باکتری جدا شود و متلاشی گردد.
- در رنگ آمیزی کپسول فیکس کردن بوسیله حرارت انجام نمی گیرد؛ برای اینکه حرارت باعث چروکیدن و بدشکل شدن سلول باکتری شده، همچنین موجب از بین رفتن کپسول می شود.
- استفاده از مقدار بسیار کمی جوهر هندی باعث شده تا کپسول بهتر مشاهده شود
- به یاد داشته باشید همواره باید اسمیر مورد بررسی رنگ آمیزی کپسول، عاری از هرگونه روغن، چربی و اثر انگشت باشد در غیر این صورت بهتر است اسلاید دیگری تهیه شود.
بیشتر بخوانید: