✍ کلون کردن ژن و مطالعه ی پروتئین های کد شده توسط ژن های کلون شده

شناسایی و مطالعه ی محصول ترجمه ی یک ژن کلون شده

قبل از بررسی این روش ها، ابتدا به روش های جداسازی محصولات پروتئینی ژن های کلون شده می پردازیم. در بسیاری از موارد نیازی به انجام این بررسی ها نخواهد بود زیرا معمولا پروتئین مورد نظر مدت ها قبل از توسعه ی تکنیک کلونینگ ژن شناسایی شده و نمونه های خالصی از آن نیز در دسترس می باشد. با این حال در برخی موارد محصول ترجمه ای ژن کلون شده شناسایی نشده است، بنابراین روشی برای جداسازی پروئتین مورد نیاز می باشد.

HRT و HART می توانند محصول ترجمه ی ژن کلون شده را شناسایی کنند

دو تکنیک مرتبط یعنی ترجمه آزاد شدن از هیبرید و ترجمه با حبس در هیبرید برای شناسایی محصول ترجمه ی ژن کلون شده به کار می روند. هر دو تکنیک به توانایی mRNA خالص شده برای هدایت سنتز پروتئین ها در سیستم های ترجمه بدون سلول مربوط می باشند. در این سیستم ها از عصاره ی سلولی دانه های گندم در حال جوانه زدن و یا سلول های رتیکولوسیتس خرگوش، که هر دو نوع سلول در ساختن پروتئین ها بسیار فعال هستند استفاده می شود. این عصاره ها حاوی ریبوزوم ها، انواعtRNAها و سایر مولکول های مورد نیاز برای سنتز پروتئین هستند. نمونه  mRNAهمراه با مخلوطی از ۲۰ نوع آمینواسید موجود در پروتئین ها که یکی از آن ها نشاندار شده می باشد (اغلب متیونین دارای ^۳۵S استفاده می شود) به سیستم ترجمه بدون سلول اضافه می شود. مولکول های mRNA به مخلوطی از پروتئین های رادیو اکتیو ترجمه می شوند که به وسیله ی ژل الکتروفورز جداسازی شده و توسط اتو رادیوگرافی ظاهر می شوند. هر باند نشان دهنده ی یک پروتئین کد شده توسط یکی از مولکول های mRNA موجود در نمونه می باشد.

هر دو روش HRT و HART در صورتی که ژن مورد مطالعه از کلون  cDNAبدست آید، بهتر عمل می کنند. در روش HRT، مولکول cDNA دناتوره شده، روی غشای نایلونی یا نیترو سلولزی بی حرکت شده و سپس با نمونه mRNA انکوبه می شود. MRNA اختصاصی cDNA با آن هیبرید شده و به صورت متصل به غشا باقی می ماند. بعد از حذف مولکول های متصل نشده، MRNA هیبرید شده بازیافت و در یک سیستم بدون سلول ترجمه می شود. این روش نمونه ی خالصی از پروتئین کد شده توسط cDNAرا فراهم می کند.

روش ترجمه با حبس در هیبرید کمی متفاوت بوده و در آن cDNAدناتوره شده مستقیما به نمونه  MRNA اضافه می شود. هیبریداسیون بین cDNAو mRNAهمتای آن صورت می گیرد اما در این مورد مولکول های mRNAمتصل نشده حذف نمی شوند و کل نمونه در یک سیستم بدون سلول ترجمه می شود. از آنجایی که mRNA هیبرید شده قادر به هدایت فرایند ترجمه نمی باشد تمام پروتئین ها به جز پروتئینی که توسط ژن کلون شده رمزگذاری شده سنتز می شوند. محصول ترجمه ژن کلون شده به عنوان پروتئین غایب دراتورادیوگراف شناسایی می شود.

بررسی پروتئین ها از طریق جهش زایی در لوله آزمایش

اگرچه HRT و HART می توانند محصول ترجمه ژن کلون شده را شناسایی کنند، اما این تکنیک ها اطلاعات کمی در مورد خود پروتئین در اختیار ما قرار می دهند. امروزه یکی از پرسش های عمده مطرح شده، ارتباط بین ساختار پروتئین و نحوه ی عملکرد آن می باشد. بهترین راه درک این مسئله، القای جهش در ژن مربوطه و سپس بررسی اثر تغییر توالی آمینواسیدی حاصل روی خصوصیات محصول پروتئینی می باشد. در شرایط طبیعی و نرمال جهش ها به صورت تصادفی رخ می دهند و یافتن یک جهش مفید نیازمند انجام غربالگری های بسیار زیادی می باشد. به منظور بر طرف کردن این مشکل از روش جهش زایی در شرایط آزمایشگاه استفاده می شود. تکنیکی که امکان ایجاد یک جهش هدفمند در نقطه ی خاصی از ژن کلون شده را فراهم می کند.

روش های ایجاد جهش در شرایط آزمایشگاه:

روش های بسیار زیادی برای دستکاری مولکول DNA به منظور ایجاد جهش در ژن های کلون شده وجود دارد. موارد زیر از ساده ترین این روش ها هستند :

1. حذف یک قطعه به روش برش بوسیله ی آنزیم محدودالاثر
2. برش ژن در یک جایگاه محدودالاثر خاص و برداشت چند نوکلئوتید توسط اندونوکلئاز اختصاصی DNA دو رشته ای مانند Bal 31 و سپس اتصال دوباره ی ژن ها به هم
3. وارد کردن یک الیگونوکلئوتید دو رشته ای کوتاه در محل شناسایی آنزیم محدودالاثر(توالی الیگونوکلئوتید را می توان به شکلی انتخاب نمود که قطعه آمینواسیدی اضافه شده به پروتئین، باعث ایجاد ساختار جدیدی مانند یک مارپیچ آلفا یا سبب ناپایداری ساختار پروتئین شود).

با وجود مفید بودن، این دستکاری ها به وجود تصادفی محل های شناسایی آنزیم های محدودالاثر در ناحیه ی مورد نظر ژن کلون شده بستگی دارد. جهش زایی هدفمند با استفاده از الیگونوکلئوتید روش کارامدتری برای ایجاد جهش در هر نقطه از ژن می باشد.

استفاده از الیگونوکلئوتید برای ایجاد جهش نقطه ای در ژن کلون شده

روش های مختلفی برای ایجاد جهش های هدفمند با کمک الیگونوکلئوتید ها وجود دارد. در اینجا یکی از ساده ترین این روش ها را بررسی خواهیم کرد. ابتدا ژن مورد نظر باید به صورت تک رشته ای آماده شود برای این منظور معمولا آن را در وکتور M13 یا فاژمید کلون می کنند، سپس DNA تک رشته ای تخلیص می شود. در ادامه یک الیگونوکلئوتید کوتاه دربردارنده ی تغییر نوکلئوتیدی مورد نظر، مکمل ناحیه ای از ژن مورد نظر که هدف ایجاد جهش در آن قسمت می باشد، سنتز می شود. با وجود عدم تطابق کامل، الیگونوکلئوتید به DNA تک رشته ای متصل شده و به عنوان پرایمری برای سنتز رشته مکمل توسط آنزیم DNAپلیمراز عمل می کند. واکنش سنتز تا ساخته شدن کامل رشته ی جدبد و ایجاد مولکول نوترکیب دو رشته ای ادامه می یابد.

پس از ورود ژن دستکاری شده به روش ترانسفکشن به درون سلول های Ecoli مستعد و سپس همانندسازیDNA، نسخه های متعددی از مولکول DNAنوترکیب ایجاد خواهد شد. طبیعت نیمه حفاظتی DNA به این معنی است که نیمی از مولکول های دورشته ای ساخته شده در هردو رشته فاقد جهش هستند، در حالی که نیم دیگر این مولکول ها در هر دو رشته جهش یافته اند. به همین ترتیب، نیمی از فاژهای حاصل حامل نسخه های فاقد جهش و نیم دیگر حامل مولکول های دارای جهش می باشند. فاژهای تولید شده توسط سلول های ترانسفرم شده روی آگار جامد کشت داده شده و ایجاد پلاک می کنند. حال نیمی از پلاک ها حاوی مولکول نوترکیب اولیه و نیم دیگر حاوی نسخه جهش یافته می باشند. برای شناسایی پلاک ها از روش هیبریداسیون به کمک الیگونوکلئوتید به عنوان پروب استفاده می شود. در این مرحله شرایط سختی برای هیبریداسیون اعمال می شود به طوری که فقط هیبریدهای با جفت بازهای کامل پایدار هستند. سلول های آلوده شده با وکتورهایM13 لیز نمی شوند بلکه به تقسیم شدن ادامه می دهند. بنابراین ژن جهش یافته می تواند در سلول های Ecoli میزبان بیان شده و پروتئین نوترکیب را تولید کند. پروتئین کد شده توسط ژن جهش یافته از سلول های نوترکیب تخلیص شده و خصوصیات آن مطالعه می شود. به این ترتیب می توان تاثیر ایجاد جهش در یک جفت باز را روی فعالیت پروتئین حاصل بررسی نمود.

تکنیک کلونینگ ژن (Gene cloning technique)