✍ آماده سازی کروموزومها به منظور مطالعه آنها 

برای مطالعه کروموزوم های انسان، سلولهای مورد استفاده باید زنده، هسته دار و قادر به تقسیم باشند که معمولترین آنها لنفوسیت های خون محیطی است، اگرچه نمونه مناسب آنالیز کروموزومی را می توان نسبتا به سهولت از پوست، مغز استخوان، عضله وپرزهای کوریونی یا سلولهای مایع آمنیوتیک و دیگر سلولهای بدن به دست آورد، ولی خون محیطی و مایع آمنیوتیک بیشتر از بقیه موارد مورد استفاده هستند. خون محیطی رابه محیط کشت حاوی فیتوهماگلوتینین اضافه می کنند که لنفوسیتهای T راتحریک به تقسیم می نماید. سلولها در دمای ۳۷درجه وبه مدت ۳ روز کشت داده می شوند تا سلولها تقسیم شده و سپس کلشی _سین به محیط اضافه می کنند. در ادامه نمک هیپوتونیک اضافه می شود که باعث لیز سلولها شده وکروموزوم ها پخش شده. سپس کروموزوم ها را روی اسلاید تثبیت(فیکس) نموده وجهت آنالیز رنگ آمیزی می کنند.

• کلشی سین، ویژگی بسیار سودمندی در جلوگیری از تشکیل دوک دارد، بطوریکه تقسیم سلولی را در متافاز متوقف می کند.

روش/تکنیک نوار بندی کروموزومها

نوار بندی G یا گیمسا متداولترین روش در آزمایشگاه های سیتوژنتیک امریکای شمالی است. دراین روش کروموزوم ها ابتدا با تریپسین تیمار می شوند تا محتوای پروتئینی آنها دناتوره شود وسپس با رنگ متصل شونده به DNA_ به نام گیمسا_رنگ آمیزی می شوند که هر کروموزوم الگوی مشخص و قابل تکراری از نوارهای تیره و روشن را نشان می دهد، نواحی تیره (مثبت) هترو کروماتین و غنی از (AT) و فقیر از لحاظ ژن هستند و نواحی باندهای روشن (منفی ) غنی از (CG) وغنی از ژن هستند. نوار بندی G ،آنالیز کروموزومی با کیفیت بالا را همراه با ۴۰۰تا ۵۰۰نوار درهر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند. هرکدام از این نوارها به طور متوسط معادل ۶۰۰۰ تا ۸۰۰۰ kb از DNA می باشند. نوار بندی با تفکیک بالای کروموزم ها در مراحل اولیه میتوز مثل پروفاز یا پرومتافاز حساسیت بیشتری تا ۸۰۰ باند درهر مجموعه هاپلوئیدی فراهم می کند، دراین روش ابتدا تقسیم سلولی با معرفی مثل متوتروکسات یا تیمیدین مهار می شود. سپس اضافه کردن اسیدفولیک یا دئوکسی سیتیدین به محیط کشت، سلول ها را وارد تقسیم میتوز می سازد، در ادامه کلشی سین در زمانی خاص که تعدادبیشتری از سلول ها درمرحله پرومتافاز می باشند و کروموزوم ها به طور کامل متراکم نشده اند، اضافه می شود.بنابراین یک الگوی نواربندی دقیق تری به دست می آید.

روش/ تکنیک نواربندی-C

این تکنیک اختصاصا نواحی هتروکروماتین اجباری اطراف سانترومر، نواحی پلی مورفیسم توارثی موجود در کرموزوم _های ۱،۹،۱۶ و انتهای بازوی بلند کروموزوم Y را رنگ آمیزی می نماید. نواحی مثبت باند C حاوی توالی DNA آلفا ساتالیت (ماهواره)شدیدا تکراری است که درمرحله همانندسازی دیرتر از سایر نقاط همانندسازی می شوند. با نواربندیCBG نوارهای C به وسیله هیدروکسید باریم و بااستفاده از گیمسا،DNAبه طور انتخابی با هیدروکسید باریم دپورینه شده و دورشته ازهم باز می شوند، سپس باگرمخانه گذاری در محلول نمکی گرم قطعات حاصل شسته می شوند. هترو کروماتین اجباری در برابر تجزیه مقاوم باقی مانده و بنابراین تنها بخشی است که به رنگ گیمسا متصل می شود. درنتیجه کروموزوم ها به صورت محو وشبح مانند دیده می شوند که اطراف سانترومر در نواحی پلی مورفیک پری سانترومری کروموزوم های ۱،۹،۱۶ ودر انتهای بازوی بلند Y به شدت رنگ گرفته و تیره هستند نواربندی C برای تعیین کروموزم های دی سانتریک، دی سانتریک کاذب و نیز مطالعه کروموزوم های مارکر و انواع پلی مورفیک مفید است. این تکنیک برای بررسی پلی مورفیسم ها سودمند می باشد.

اندازه band_C ها:

اندازه band_Cها ممکن است از فردی به فرد دیگر تغییر کند و متفاوت باشد و این ممکن است با مقادیر متفاوت DNA ساتالیت مطابقت داشته باشد.

روش/ تکنیک نواربندی  R –(نواربندی معکوس)

این تکنیک دارای الگوی نواربندی مخالف نوار بندی_G است ، به این ترتیب که نواحی که در G به صورت تیره و هتروکروماتینی دیده می شود، در R به صورت روشن و یوکروماتینی است. با این وجود تعداد نوارها. در هر دو روش کامال یکسان است. از محلول نمک داغ برای دناتوره کردن DNA وبرای هضم پروتئین از گرما استفاده می شود و رنگ آمیزی با رنگ گیمسا انجام می شود.

تکنیک banding_R  بسیار سودمند است برای مطالعه ساختارهای انتهایی کروموزوم ها، زیرا این ساختارها در banding_G به صورت روشن دیده می شود.

روش/تکنیک نواربندیT (نواربندی تلومر)

نواربندی Tنوعی نواربندی R است که دران فقط نواحی انتهایی کروموزوم ها یا تلومرها رنگ می گیرند. تیمار شدیدتر کروموزوم ها، رنگ پذیری را به جز در نواحی تلومر که مقاوم به حرارت هستند کاهش می دهد. تکنیک های نواربندی T به صورت فلورسنت وغیرفلورسنت هستند.

روش/تکنیک رنگ آمیزی cd (نقطه سانترومری یا رنگ آمیزی کینه توکور)

دراین تکنیک یک جفت نقطه در هر سانترومر روی هر کروماتید ایجاد می شود. این نقاط مختص نواحی سانترومری هستند و مشابه نوارهای C نمی باشند. برخلاف نواربندی C که نواحی سانترومری فعال و غیرفعال در آن رنگ می شدند، تنها سانترومرهای عملکردی یا فعال با رنگ آمیزی cdرنگ می گیرند . رنگ آمیزی cdبرای تمایز سانترومرهای عملکردی از غیر عملکردی و نیز مطالعه جابه جایی های رابرت سونی جابه جایی سانترومرها در کروموزوم های آکروسانتریک، کروموزوم های حلقوی وکروموزوم های مارکر استفاده می شود .

روش/تکنیک نوار بندی – ۱۱ G(گیمسا در PH یازده)

این تکنیک به طور اختصاصی نواحی پری سانترومریک تمام کروموزوم ها، نواحی هتروکروماتینی کروموزوم های ۱،۹،۱۶ و انتهای Yq و ساتالیت های کروموزوم های اکروسانتریک را رنگ آمیزی می کند. با تیمار قلیایی،نواحی اتصال گیمسا از بین می رود. بهترین نتیجه در ۱۱/PH6 بدست می آید. دراین PH شدیدا قلیایی، تنها ترکیب azure از گیمسا به اکثریت کروموزوم ها متصل شده و آنها را به رنگ آبی روشن در می آورد. ترکیب eosin درگیمسا به نواحی هترومورفیک ذکر شده متصل می شود و آنها را به رنگ ارغوانی در می آورد. نوار بندی ۱۱_G برای تشخیص این پلی مورفیسم های هتروکروماتینی به کار می رود. نواربندی۱۱_G کاربرد تحقیقاتی نیز دارد و در سلول های هیبرید برای تمایز کروموزوم های انسانی و جونده از هم به کار می رود. کروموزوم های انسانی آبی رنگ می شوند در حالی که کدوموزوم هوی موشی با رنگ ارغوانی حفظ می شوند.

روش/تکنیک NOR_banding (رنگ آمیزی نقره برای نواحی سازمان دهنده هستکی)

این تکنیک به طور انتخابی نواحی سازمان دهنده هستکی(NORs )در ساقه ماهواره ای کروموزوم های آکروسانتریک را رنگ آمیزی می نماید. این نواحی حاوی ژن های RNA ریبوزومی هستند و با نیترات نقره رنگ می گیرند. به لحاظ تئوری ۱۰ NOR در هر سلول (یک مورد به ازای هر کروموزوم آکروسانتریک) وجود دارد. با این وجود همیشه تمام آنها رنگ نمی گیرند چرا که نیترات نقره تنها ژن های rRNA فعال را رنگ می کند. نواحی NOR دارای کپی های زیادی از ترادفهای rDNA یا ژن های مربوط به بخش بزرگتر ۲۸۵) RNA ریبوزومی) همچنین(S18) می باشند. الگوی NOR-Ag کروموزوم های آکروسانتریک در یک فرد دارای ویژگی های قابل توارث ثابت بوده و در مجموع با الگوهای R بندها در شناسایی منشا والدینی و همچنین برای disjunction- Non  میتوزی در تریزومی های کروموزوم های آکروسانتریک انسانی کاربرد دارند.

کاربردهای تکنیک NOR_banding

• برای شناسایی کروموزوم های مارکر
• مطالعه پلی مورفیسم کروموزوم های آکروسانتریک

روش/تکنیک نوار بندی Q (نواربندی کوئیناکرین)

اولین نوار بندی کروموزوم های انسان روش نوار بندی Q بود که یک تکنیک فلورسنت است. در این روش تعدادی از فلوروکروم ها مثل کوئیناکربن دی هیدروکلراید به DNA اتصال پیدا می کند و در صورت تحریک با طول موج مناسب، الگوی نواربندی تیره و روشن بوجود می آورند. در تکنیک نواربندیQ ، نواحی تیره و روشن ایجاد می شود که قابل تشخیص و متمایز هستند و نواحی روشن غنی از A_T هستند. نکته مهمی که باید به آن توجه کنید این است که در نواربندی به روش Q ، شبیه نوار بندی G  است بجز چند مورد. ناحیه انتهایی بازوی بلند کروموزوم Y و نواحی پلی مورفیک (چندشکلی) پری سانترومری که در روی کروموزوم ۱ و ۱۶ قرار دارند، رنگ فلورسنت را گرفته و روشن دیده می شوند. در نواحی پلی مورفیک باند Q در سانترومر کروموزوم های ۳و۴ وجود دارد و با نوار بندی G مشخص نمی شود، پس نتیجه گیری می شود که تکنیک نواربندی Q  تایید حضور کروموزوم Y و یا نواحی پلی مورفیک که در بالا توضیح دادم مناسب است.

اکثر رنگ های فلورسنت پایدار نیستند و باید برای حل این مشکل از اتاق تاریک و میکروسکوپ های فلورسانس گران قیمت استفاده کنند، به این دلیل نواربندی Q در بیشتر آزمایشگاه ها به شکل متعارف انجام نمی شود و به جای آن تکنیک FISH بکار می برند.

روش/تکنیک نواربندی-R (نواربندی معکوس)

در این تکنیک الگوی نواربندی مخالف نوار بندی های G و Q است ، به این ترتیب که نواحی که در G به صورت تیره و هتروکروماتینی دیده می شود، در R به صورت روشن و یوکروماتینی است. این تکنیک به دو روش فلورسنت و غیر فلورسنت انجام می شود. از محلول نمک داغ برای دناتوره کردن DNA و برای هضم پروتئین از گرما استفاده می شود و رنگ آمیزی با رنگ گیمسا انجام می شود. تکنیکR_banding بسیار سودمند است برای مطالعه ساختارهای انتهایی کروموزوم ها، زیرا این ساختارها در G_banding به صورت روشن دیده می شود. 

رنگ آمیزی DAPI/DA(۴ و۶ دی آمینو ۲- فنول۱ ایندول/ دیستامایسینA )

دراین رنگ آمیزی، از یک رنگ فلورسنت به نام DAPI و یک آنتی بیوتیک غیر فلورسنت تحت عنوان دیستامایسین A باهم استفاده می شوند، هر دو در نواحی دو رشته DNA غنی از A_T باندهای پایدار و مشابه غیر یکسان ایجاد می کنند. وقتی به طور همزمان این دو ( DAPI/DA) استفاده می شود، بعضی از نواحی هتروکروماتین اجباری غنی از بازهای A_‌T در نواحی باند C کروموزوم های ۱۶،۹،۱ و همچنین انتهای Yq و همینطور بازوی کوتاه کروموزوم ۱۵ فلورسانس می شوند.

• برای تمایز نواحی ساتلایت در کروموزوم های اکروسانتریک پیش از اینکه روش FISH ابداع شود، تنها تکنیک مورد استفاده همین رنگ آمیزی DAPI/DA  بود.

کاربرد روش رنگ آمیزی DAPI/DA

بازآرایی کروموزوم ۱۵ را شناسایی می کند، تنوع در نواحی پلی مورفیک کروموزوم های ۱، ۹، ۱۶ را تایید می کند، و از این روش رنگ آمیزی برای مطالعه کروموزوم های مارکر با ماهواره ها مورد استفاده قرار می گیرد.