✍ روشهای کاربردی جهت تشخیص هویت سلول ها

در این روش با تغییر سیستم آزمایش می شود مهارکننده های اختصاصی متالوپروتئینازها را هم اندازه گیری کرد. برای این کار، طبق پروتوکل زایموگرافی عمل می کنیم و در مرحله ی نهایی پس از جدا شدن SDS از ژل به جای بافر زایموگرافی از بافری که غنی از پروتئازهای خاص باشد، استفاده می شود. به عنوان مثال برای بررسی TIMP1 و TIMP2 ژل را در محیط کشت رویی فیبروبلاست که به آن ۴-آمینوفنیل مرکوریک اسید جهت فعال کردن متالوپروتئینازها اضافه شده، انکوبه می کنیم و پس از ۱-۸ ساعت ژل را رنگ آمیزی و سپس رنگ بری می کنیم. پروتئین های موجود در قسمتهایی از ژل که فاقد مهارکننده باشند توسط پروتئاز های مایع رویی کشت تجزیه می شوند، بنابراین این مناطق پس از رنگ آمیزی ژل شفاف خواهند بود ولی سوبستراهای پروتئینی موجود در بخشهایی از ژل که حاوی مهارکننده های اختصاصی پروتئاز هاست، تجزیه نشده و پس از رنگ آمیزی بصورت آبی رنگ دیده می شوند. علاوه بر این، با روش زایموگرافی، می توان تاثیر مهارکننده های مختلف دارویی را روی فعالیت آنزیم تعیین کرد و عوامل مهارکننده این پروتئاز ها را مشخص کرد. یعنی بعد از اتمام الکتروفورز به بافر انکوباسیون مقدار مشخصی از ماده ی مهار کننده اضافه کرد و میزان کاهش فعالیت پروتئازی را در مقایسه با فعالیت اولیه آنزیم سنجید. برای این کار، یک نمونه در چند خط الکتروفورز شده و بعد این خطوط بریده شده و هرکدام با مهارکننده ی خاصی مورد بررسی قرار می گیرد. از این خصوصیت زایموگرافی جهت تعیین نوع آنزیم نیز می توان استفاده کرد. علاوه بر این از این روش برای بررسی مهارکننده های اختصاصی فعال کننده های پلاسمینوژن (PAI-2و PAI-1 )  نیز استفاده می شود.

تکنیک/روش ماتریژل

استفاده از ماتریژل (ژل تهیه شده از پروتئین های ماتریکس خارج سلولی) روش دیگری برای بررسی فعالیت ماتریکس متالوپروتئیناز ها است. این ژل را به دو روش مختلف به کار می برند. در یک روش از ماتریکس نشان دار شده با ماده ی رادیو اکتیو استفاده می شود. در این روش سوسپانسیون سلولی را روی ماتریژل اضافه می کنند و میزان آزاد مواد رادیو اکتیو را در مایع رویی محیط کشت اندازه گیری می کنند.

در روش دیگر سلول ها را بر روی ماتریژل کشت می دهند و بعد از مدت معینی ژل را از نظر میزان نفوذ سلول ها، با میکروسکوپ بررسی می کنند. سلول هایی که متالوپروتئیناز های غشایی داشته باشند، می توانند به دنبال تجزیه ی پروتئین های ماتریکس در ژل نفوذ کنند. بقیه ی سلول ها به طور عادی روی ژل رشد می کنند و داخل ژل وارد نمی شوند. با این روش قدرت تهاجم سلول های سرطانی را می توان بررسی کرد و حضور متالوپروتئینازهای غشایی را نشان داد. این آزمون حتی ممکن است در آینده برای تعیین قدرت متاستاز سلول های سرطانی به کار گرفته شود.

تکنیک های/ روش های ایمونولوژیک

یکی از ساده ترین روش های بررسی متالوپروتئیناز ها سنجش مقدار آن ها با استفاده از روش های ایمونولوژیک است. این روز ها علیه اکثر آنزیم های فوق آنتی بادی مونوکلونال تهیه شده است . حتی علیه مهارکننده های اختصاصی متالوپروتئینازها ، پروآنزیم ها و مجموعه های متالوپروتئیناز متصل به مهار کننده هم آنتی بادی اختصاصی تهیه شده. به کمک این آنتی بادی ها تست هایی مثل الایزا، رادیو ایمونواسی و وسترن بلات را می توان طراحی کرد و به راحتی مقدار هر کدام از پروتئاز ها یا مهارکننده های آنها را بصورت کمی تعیین کرد. امروزه با روش های ایمونو هیستوشیمی محل حضور متالوپروتئیناز خاصی را در بافت یا رده سلولی خاص نشان می دهد و به کمک روش های پیشرفته ی بیولوژی مولکولی و ایمونوژنتیک مثل نورثرن بلات و RT-PCR کمی، میزان بیان هر کدام از آنزیم های فوق را می توان تعیین کرد.

آزمون انگشت نگاریDNA :

انگشت نگاری DNA از چندین لوکوس ژنی و تعیین پروفایل DNA به وسیله ی PCR مولتی پلیکس از جمله آزمون هایی هستند که در بانک های سلولی انجام می شوند. به کمک انگشت نگاری DNA می شود تیره های سلولی مختلف جداشده از یک گونه ی حیوانی را از همدیگر متمایز کرد . از این تکنیک بیشتر برای اثبات یکسان بودن ویال های کاری بانک سلولی با سلول های مرجع یا اصلی بانک سلولی و تشخیص آلودگی های متقاطع سلولی استفاده می شود.

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش اول

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش دوم

تکنیک ها/روش های شناسایی و تشخیص هویت سلول ها – بخش سوم