✍پروتکل تکنیک ذوب یا دِفریز سلول ها در آزمایشگاه های سلولی

برای ذوب سلول و استفاده ازآنها برای کشت مجدد یا آنالیزهای مولکولی، داشتن سرعت عمل و استریل و بدون آلودگی کار کردن بسیار مهم است. متاسفانه هم به دلیل حساس بودن این تکنیک و هم عدم مهارت تکنسین اکثر اوقات تعدادی از سلول های فریز شده را درمرحله ی ذوب از دست می دهیم.

 دستورالعمل/روش ذوب سلول ها:

۱-ابتدا از همه باید در یه فالکون ۱۵، ۵ ml محیط کشت حاوی FBS آماده می کنیم.

۲-بعد از آن کرایوویال هایی که داخل آن سلول ها را قرار دادیم از تانک نیتروژن بصورت تک تک خارج می کنیم.

نکته ی بسیار مهم: بعد از خارج کردن کرایوویال خیلی سریع در آن را باز می کنیم تا گاز ازت خارج شود. یادتان باشد اگر زمان را از دست دادید و نتوانستید سریع عمل کنید کرایوویال را به یک جای امن مثلا سطل زباله ی آزمایشگاه بیندازید وگرنه در دستتان منفجر می شود و اگر عینک مخصوص نزده باشید به شما آسیب می زند.

۳-به موقع در کرایوویال را باز کنید و گاز ازت که خارج شد، مجددا در ویال را ببندید و انتهای کرایوویال که حاوی سلول های منجمد است را داخل بن ماری ۳۷ درجه سانتیگراد قرار دهید.در همین حین باید کرایوویال را بصورت دورانی و آرام حرکت دهید .به محضی که دیدید بلور منجمد از جداره ی ویال جدا شد به زیر هود منتقل کنید.

۴-الکل کشی زیر هود بسیار مهم است و کرایوویال هم از این قاعده مستثنی نیست. بعد از الکل کشی در ویال را باز کنید و سوسپانسیون سلولی را قطره قطره به لوله ی حاوی محیط کشت اضافه و پیپتاژ کنید. از آنجایی که سلول ها خیلی ارزشمندند، نباید چیزی در ویال جا بماند، پس با۱ml محیط کشت جداره های ویال را شستشو  دهید و به لوله ی اصلی منتقل کنید.

۵-سپس لوله ی حاوی سلول ها را برای ۵ دقیقه در سانتریفیوژ قرار دهید. بعد محیط رویی را خارج کنید و۱ml محیط کشت تازه ی حاوی FBS به سلول ها که ته نشین شدن اضافه کنید.حالا یک سوسپانسیون سلولی داریم که می توانیم تکنیک های گذشته مثل شمارش سلول ها و درصد زنده مانی را روی آنها انجام دهیم.

۶-بعد از شمارش، محیط کشت کامل با ۲۰% FBS به سلول ها اضافه کنید داخل فلاسک یا پلیت می ریزیم و حالا می شود مجدد این سلول ها را کشت داد و به پاساژ های دیگری برد.

تکنیک فریز کردن سلول ها (Cell Freeze Technique)