✍ حل مشکل زمان بر بودن و بالا بودن احتمال وقوع اشتباه تعیین توالی سنگر

با توجه به آن چه گفته شد انجام برخی اصلاحات الزامی بودند به خصوص اگر قصد ما از توالی یابی، ژنوم های بزرگی مثل ژنوم انسان بود. به همین منظور در اوایل دهه ۱۹۹۰  ماشین های توالی یابی اتوماتیک به صورت تجاری به بازار عرضه شدند که هم  سریع تر بودند و هم احتمال خطا در آن ها به مراتب کم تر شد. اگر چه هزینه راه اندازی این تکنیک به دلیل گران بودن دستگاه آنالیز کننده توالی بسیار بالاست ولی از آنجایی که آنالیز چندین نمونه به صورت هم زمان است در نهایت هزینه توالی یابی هر نمونه بسیار پایین است. در این نوع توالی یابی، مخلوط واکنش دارای ۴ نوع دئوکسی نوکلئوتید نرمال، ۴ نوع دی دئوکسی نوکلئوتید، یک پرایمر، DNA الگو و DNA پلیمراز می‌باشد که جهت جداسازی دی دئوکسی نوکلئوتیدها از هم، از چهار رنگ فلورسنت متفاوت به عنوان لیبل برای هر یک از چهار واکنش اختصاصی باز استفاده می‌شوند که با استفاده از رنگ‌هایی که طول موج نشری متفاوت دارند، می‌توان هر چهار واکنش را به صورت یک نمونه در چاهک ژل وارد کرد.مراحل انجام واکنش دقیقا همانند PCR معمولی است که تکثیر در دستگاه Thermal cycler انجام می گیرد. در هنگام پلیمریزاسیون، این امکان وجود دارد که دی دئوکسی نوکلئوتیدها متصل شده و زنجیره DNA خاتمه یابد.نسبت دی دئوکسی نوکلئوتیدها به دئوکسی نوکلئوتیدها باید طوری باشد که توقف همانندسازی حتما در هر کدام از بازهای A، G، T و C صورت بگیرد.

بعد از آن که پلیمراز از توالی الگو هزاران نسخه که هر کدام در نوکلئوتید متفاوتی خاتمه پیدا کردند، تهیه کرد، تمام مخلوط واکنش در یک ستون الکتروفورز می شود که قطعات DNA از منبع تحریکی همانند لیزر عبور می‌کنند. در این هنگام، هم زمان با عبور قطعات DNA از نقطه‌ای مشخص در ژل، سیگنال‌های فلورسنت شناسایی و ضبط می‌شوند. در نهایت، یک intensity profile برای هر یک از فلوروفورها ایجاد می شود که در آن، هر یک از چهار رنگ باز متفاوتی را نشان می دهند. هم زمان اطلاعات به طور الکترونیکی ذخیره‌ می‌شوند.

ابتدا از ژل slab پلی آکریل آمید برای این منظور استفاده می‌کردند، ولی با توالی یابی capillary که نمونه‌های DNA از طریق لوله‌های شیشه‌ای موئین بلند و بسیار نازکی که قطرشان در حدود ۰/۱ میلی‌متر است و دارای ژل پلی آکریل آمید هستند، الکتروفورز می‌شوند، می توان ظرفیت فرایند توالی یابی DNA را به میزان زیادی افزایش داد.

روش سنگر (sanger) – نسل اول تعیین توالی DNA

تکنیک توالی یابی ماکسام گیلبرت – روش تجزیه شیمیایی یا شکست زنجیر

 توالی یابی به روش پیروسکانس (Pyrosequencing)/پایروسیکوئنسینگ

تکنولوژی تعیین توالی ایلومینا (Illumina)