✍ دستورالعمل ها/پروتکل های مرحله هاروست

در مرحله هاروست با اضافه کردن یک بازدارنده میتوتیک (colcemid) و رشد کشت با تحت تاثیر قرار دادن با محلول هایپوتونیک که سلول ها را متورم می کند، و در پایان سلول ها با استفاده از مخلوط با نسبت ۳:۱ متانول : اسید استیک فیکس می شوند.

هاروست درجا in situ

این روش برای کشت هایی که مستقیما در coverslips یا اسلایدها رشد داده می شوند مورد استفاده قرار می گیرد.

نکته ای که باید به آن  توجه کنیم این است که، چون سلول ها روی سطحی که رشد داده می شوند، هاروست می شوند، مهم که لایه رشد سلولی خیلی ضخیم نباشد، چون این بر روی گسترش کروموزومی موثر است. در آزمایشگاه های پیشرفته، پروسه با استفاده از یک هاروست کننده رباتیک انجام می شود (Hamilton Microblab 2200) که اجازه می دهد ۴۰ ظرف همزمان هاروست شوند. درست است که این اعمال طولانی تر از هاروست کشت با دست است، اما چندین مزیت دارد:

در وقت کارشناس صرفه جوئی می شود ( ۳ یا ۴ نفر کارشناس برای هاروست دستی ۴۰ کشت، مورد نیاز است).

دومین مزیت این است که روش قابل اعتماد و ثابتی است.

سومین مزیت این است که بخارات سمی فیکساتیو را در مکان محدود می کند.

 

هاروسترهای رباتیک تجارئی وجود دارد و در هر دستگاه نرم افزاری نیاز است که مطابق با پارامترهای بهینه برای هاروست کردن است. این پارامترها شامل:

* جدا سازی محیط

* جزء به جزء کردن (تقسیم) هایپوتونیک

* اضافه کردن تدریجی و متوالی فیکساتیو به هایپوتونیک

* جداسازی  مخلوط هایپوتونیک / فیکساتیو

تغییرات فیکساتیو

توضیحات

روش استاندارد، انتخاب کشت ها در صبح، پیش از هاروست واقعی و اضافه کردن مخلوط کلسمید و BrdU عصر همان روز است (تایمدین  آنالوگ BrdU است که در رشته DNA تازه ساخت قرار گرفته و در این نواحی ایجاد decondensation خفیفی می کند که به ایجاد کروموزوم های بلندتر کمک می کند). این کشت ها، معمولا به صورت رباتیک هاروست می شوند. مگر اینکه بیش از چهل نمونه برای هاروست وجود داشته باشد، و یا اگر مشکلی برای ماشین هاروستینگ اتفاق بیوفتد، که در این حالت لازم است که نمونه ها را دستی هاروست کنید. گاهی یک کشت اضافی لازم است، که یک مورد (بیمار) را کامل کند و در این موقعیت کلسمید به تنهائی به کار می رود.

 

دستورالعمل/پروتکل ۳ – کشت های coverslip هاروست در جا

لوازم و محلول ها:

هود لامینار میکروبیولوژی  Class2

انکوباتو، با سه gas یا گاز CO2 در ۳۷ درجه سانتی گراد

پتری دیش پلاستیکی۳۵mm

پیپت پاستور پلاستیکی   ۱ml

پیپت پلاستیکی۵-۱۰ml

فورسپس نازک

محلول مخلوط BrdU/ colcemid، ترکیب ۳mg /ml (Sigma) BrdU  محلول کار در PBS وکلسمید ۱ µg/ml محلول کار در محیط پایه  MEM: فیلترکنید و در درجه حرارت -۲۰ درجه سانتی گراد نگهداری کنید.

میکروپیپت و tips (سرسمپلر) ۵۰µl

هاروستر رباتیک (کاربردی)

محلول سدیم سیترات۰.۸%

فیکساتیو: متانول – اسید استیک گلاسیال، ۳:۱

محیط کشت کامل

 

روش کار:

الف – هاروستینگ

۱- صبح، کشت های مناسب برای هاروست روز بعد را، انتخاب کنید.

۲- یا اینکه محیط را تغییر دهید، ۲ml محیط تازه اضافه کنید و یا اگر رشد back-up در دیش اصلی وجود دارn، coverslip به یک دیش لیبل شده جدید منتقل کنید و ۲ mlمحیط تازه اضافه کنید.

۳- در ۳۷ درجه سانتی گراد، تا حدود ساعت ۵ بعد از ظهر، در یک انکوباتور سه گازه یا CO2 دار، انکوبه کنید.

۴- تو این مرحله ۵۰µl مخلوط Colcemid /BrdU به هر دیش اضافه کنید و در ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور CO2 دار، overnight انکوبه کنید.

۵- صبح روز بعد، کشت ها را با استفاده از یک هاروستر روباتیک، با نرم افزاری که برای انجام مراحل شرح داده شده، طراحی شده، و یا مراحل ۱۳-۶ را به طور دستی دنبال کنید.

۶- مخلوط محیط /BrdU / کلسمید را بردارید، با ۲ ml محلول سیترات سدیم ۸/.% جایگزین کنید، و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در درجه حرارت اتاق بگذارید بماند.

۷- درست پیش از پایان ۳۰ دقیقه، فیکساتیو را درست کنید، و پتری دیش ها را بر روی درپوش قرار دهید.

۸- با استفاده از یک پیپت پاستور پلاستیکی، چهار قطره فیکساتیو به هر دیش اضافه کرده، و دو دقیقه منتظر بمانید (سعی کنید از قرار دادن فیکساتیو به طور مستقیم  بر روی سلول ها اجتناب کنید.

۹- حالا ۸ قطره فیکساتیو اضافه کنید و ۲ دقیقه صبر کنید.

۱۰- بعد  ۲ ml فیکساتیو اضافه کنید و ۲ دقیقه منتظر بمانید.

۱۱- مخلوط هایپوتونیک / فیکساتیو را با استفاده از یک پیپت پاستور پلاستیکی جدا کنید و با ۲ ml فیکساتیو تازه عوض کنید ( این مرحله یک بار با یک دیش برای جلوگیری از خشک شدن coverslips انجام دهید.)

۱۲- فیکساتیو تازه درست کنید و سه بار فیکساتیو را عوض کنید، بین هر تغییر یک دقیقه منتظر بمانید.

۱۳- فیکساتیو تازه برای تغییر فیکساتیو پایانی درست کنید، و سپس در پوش ها را تمیز کنید و آنها را روی دیش ها قرار دهید.

ب- تهیه گستره کروموزومی

۱- در این مرحله coverslip را از روی dish بردارید و فیکساتیو اضافی را بیرون بکشید ( با یک کاغذ جاذب برای اجتناب از طولانی شدن زمان خشک شدن و تجمع فیکساتیو).

۲- با کناره بالای سلول کار کنید، اجازه دهید coverslip تا مشاهده حلقه های Newton خشک شود. ( اثر رنگین کمان غبار مانند که بر روی سطح ظاهر می شود)، یک قطره فیکساتیو از یک ارتفاع تقریبا ۲cm بر روی لام بچکانید (این می تونه برای انجام spreading مناسب متفاوت باشد).

۳- اجازه دهید که قطره فیکساتیو به گوشه های coverslip برسد و بعد کاملا فیکس را بیرون بکشید و دوباره پیش از اینکه در معرض هوا خشک شود فیکس اضافه کنید. گاهی، لازم است که ۲ قطره فیکساتیو برای تحریک اسپردینگ به کار ببرید.

۴- دراین مرحله coverslip را بر روی slid مونت کنید،طرف بالای سلول برای نواربندی آماده است.

توجه: BrdU می تواند صدمه ژنتیکی قابل توارث ایجاد کند، و به بچه متولد نشده ( unborn child) صدمه بزند،  همچنین برای تنفس هم مضر است، و در تماس با پوست اگر بلعیده شود خطرناک است .

کلسمید هم سمی و خطرناک است، و اگر بلعیده شود، امکان خطر برای بچه متولد نشده دارد.

توجه: متانول خیلی قابل اشتعاله و برای دستگاه تنفسی سمی است. اسید استیک سوختگی های شدید ایجاد می کند و در تماس با پوست مضر است.

نکته: هاروستر رباتیک در آزمایشگاه برای اضافه کردن ۳ml هایپوتونیک، و مراحل پرفیکس ۰.۳۷۵ml، ۰.۵ml  و ۲ml فیکساتیو طراحی شده. سپس مخلوط هایپوتونیک / فیکساتیو برداشته می شود و با ۳ml فیکساتیو عوض می شود و بعد با چهار تعویض کامل فیکساتیو دنبال می شود.

بلافاصله به دنبال هاروست کروموزوم ها رو آماده کنید. اگر آماده نیست، دیش ها را در درجه حرارت اتاق قرار دهید و در فریزر نگهداری نکنید.

 

 دستورالعمل/پروتکل ۴ – هاروست در جا فقط با کلسمید:

مواد و وسایل: 

هود لامینار Class2

انکوباتور سه گازه یا CO2 دار ۳۷ درجه سانتی گراد

پتری دیش های پلاستیکی ۳۵ml

پیپت های پلاستیکی      ۵-۱۰ml

پیپت پاستور پلاستیکی ۱ml

فورسپس نازک

محلول کلسمید: ۱۰µg/ml  در HBSS

محلول سدیم سیترات، ۰.۸%

فیکساتیو: متانول _ اسید استیک گلاسیال، ۳:۱

محیط کشت کامل

 

روش کار:

۱- کشت های مناسب را برای هاروست انتخاب کنید.

۲- محیط راتغییر دهید یا coverslip را به یک دیش جدید منتقل کنید، و همانطور یکه مناسب است ۲ ml محیط تازه اضافه کنید.

۳- دو قطره کلسمید از یک پیپت پاستور پلاستیکی۱ml (50µl) را به هر دیش اضافه کنید.

۴- دیش ها را در ۳۷ درجه سانتی گراد در یک انکوباتور گاز دار به مدت ۷۵-۶۰ دقیقه انکوبه کنید.

۵- مخلوط محیط / کلسمید  رابردارید و پروتکل ۳ را از مرحله ۶ دنبال کنید.

 

روش/ دستورالعمل هاروست سوسپانسیون

این روش برای هاروست سلول های رشد داده شده در تیوب یا فلاسک استفاده می شود. سلول ها نمی توانند در جا هاروست شوند، بنابراین رشد بیشتر  confluent، با جمع آوری سلول هایی است که به طور فعال در حال تقسیم در اطراف لبه های این تکه های ضخیم تر باشد. بسته به میزان رشد، کشت می تواند یا مستقیما هاروست  شود و یا ۲ h قبل از هاروست sub-culture

دستورالعمل/پروتکل ۵ – هاروست سوسپانسیون

مواد و وسایل:

هود لامینار میکروبیولوژی class2

انکوباتور (گاز دار یا بدون گاز) در ۳۷ درجه سانتی گراد

پیپت پلاستیکی ۵-۱۰ml

پیپت پاستور پلاستیکی ۱ml

پیپت پاستور شیشه ای ۱۵۰mm

لوله های سانتریفوژ، ته مخروطی ۱۰ml( ترجیحا شیشه ای)

میکروسکوپ اینورت (X4 چشمی)

اسلاید های تمیز شده میکروسکوپی

کلسمید / محیط   Ham s F10  ( غلظت نهایی۰.۶ µg/ml ‌ کلسمید در Ham s F10 )

آب استریل

TV

فیکساتیو : متانول _ اسید استیک گلاسیال،۳:۱

 

روش کار:

۱- یک کشت مناسب برای هاروست انتخاب کنید، یا مستقیما و به دنبال تریپسینه کردن از روز قبل هاروست کنید.

۲- کشت را با colcemid / F10 Ham s  ۰.۵mlشستشو دهید و ۱ ml از این محیط اضافه کنید.

۳- در ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت۲۴h  انکوبه کنید.

۴- کشت را برای سلول های تقسیم شده جمع آوری شده چک کنید.

۵- محیط را بیرون بریزید، با TV  ۰.۵ml استریل بشوئید و TV 1ml اضافه کنید. به مدت ۵ دقیقه در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.

۶- از میکروسکوپ invert استفاده کنید. چک کنید که سلول ها از سطح جدا شدن و به تدریج لوله را تکان دهید تا مطمئن شوید یک سوسپانسیون تک سلولی ایجاد شده.

۷-  در این مرحله  ۱.۵ml آب استریل گرم اضافه کنید و در داخل یک لوله سانتریفوژ ته مخروطی بریزید (ترجیحا شیشه ای).

۸- به مدت ۵ دقیقه در دور۲۰۰g سانتریفوژ کنید.

۹- محلول رویی را بیرون بریزید ( در داخل ظرف استریل) و بتدریج لوله را تکان دهید تا دوباره پلیت به صورت سوسپانسیون در آید.

۱۰- بتدریج فیکساتیوی را که تازه ساخته شده قطره قطره با یک پیپت پاستور شیشه ای، در حالی که ته لوله را تکان می دهید تا مطمئن شوید پلیت سلولی کاملا مخلوط شده، اضافه کنید.

۱۱- در ۲۰- درجه سانتی گراد به مدت ۳۰ دقیقه تا یک ساعت قبل از تهیه اسلاید نگهداری کنید.

۱۲- اسلایدها را همانطور که در تهیه لام در بخش کشت خون محیطی گفته شده درست کنید.

توجه: تریپسین چشم ها را می سوزاند، و به سیستم تنفسی و پوست آسیب وارد می کند و همچنین می تواند در اثر تنفس حساسیت ایجا کند.

 

دستورالعمل/روش پیپت

این روش هاروست، شامل آسپیره و جدا کردن سلول های در حال تقسیم از یک کشت در حال رشد است، پس از استفاده کردن کلسمید قبل از کشت آماده برای هاروست است. سپس سلول ها تحت اثر هایپوتونیک قرار می گیرند و قبل از چکاندن بر روی یک لام میکروسکوپی سریع فیکس می شوند. اگر چه این روش در مقیاس وسیع واقعا قابل کاربرد نیست ولی در یک آزمایشگاه تشخیصی شلوغ و فقط با یک سیستم کشت باز سازگار است.

 

آماده کردن کروموزوم

بدون در نظر گرفتن روش انتخابی هاروست، مشاهده نهایی برای متافازهای خوب پخش شده، قابل انجام است. بحرانی ترین مرحله خشک کردن preparation هاست. اگر preparations خیلی سریع خشک شوند، کروموزوم ها معمولا ضعیف spread می شوند. و در زیر میکروسکوپ فاز کنتراست درخشان به نظر می رسند. بنابراین خشک کردن خیلی آهسته منجر به تولید کروموزوم های خیلی پخش می شود، یعنی کروموزوم هایی که ظاهر کمرنگ خاکستری دارند. خشک شدن اسلایدهای کروموزومی به رطوبت بستگی دارد و به خوبی می دانید که spread کروموزومی تحت تاثیر شرایط آب و هوایی است. بهترین شرایط یک رطوبت نسبی حول و حوش ۵۰% و درجه حرارت حدود ۲۱ درجه سانتی گراد است. به طور ایده آل، یک اتاق با set یکنواخت air-condition برای کنترل درجه حرارت و رطوبت در یک سطح ثابت باید قابل دسترس باشد. این شرایط آماده کردن، لام ها را استاندارد می کند و بنابراین نواربندی لام ها هم استاندارد می شود. قبل از G-banding این لام ها باید age شوند یا با نور UV (  germicidal  ۳۰w و طول موج ۲۵۳.۷nm  ) برای تقریبا ۴۰ ثانیه یا استفاده از اجاق (۴۵ دقیقه در یک اجاق ۶۰ درجه سانتی گراد یا overnight بر روی یک hot plate ).

 

پروتکل/دستورالعمل کاربردی کشت AF

۱-نمونه را به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ rpm سانتریفوژ کنید.

۲- محلول رویی (supernatant) را حذف و محیط تازه به کشت اضافه کنید.

در اینجا با توجه به رسوبی که ایجاد شده، می توان تعداد لوله های کشت را انتخاب کرد و در صورت کشت در لوله  ۱-۵ cc Lighton محیط  و کشت در فلاسک ۳ cc محیط اضافه کنید.

۳- بعد از ۷-۵ روز نمونه را به آرامی از انکوباتور خارج و با invert microscope  آن را بررسی کنید. در صورت مشاهده کلنی، محیط آن را برداشته و با محیط تازه تعویض کنید.

۴- دو روز درمیان، نمونه ها را با  invert microscope  بررسی کرده و محیط آن را تعویض کنید.

۵- بعد از رشد کلونی به اندازه کافی، می شود یکی از لوله ها را هاروست کرده و لوله دیگه را subculture داد.

۶-  subculture کردن نمونه، به این صورت است، که نمونه مورد نظر را انتخاب کرده، سپس محیط آن را در لوله ای جداگانه می ریزیم، سپس نمونه را با PBS 37 درجه شستشو داده و محلول اون رو به لوله فوق اضافه می کنیم. ( دو بار با PBS می شوئیم).

۷,۱- به لوله  ۰.۵cc  Lighton، و به فلاسک ۱cc محلول  (۱X) ،trypsin-EDTA، ۳۷ درجه سانتی گراد بریزید و به مدت ۳۰ ثانیه درون ۳۷ درجه قرار دهید. ( برای جدا شدن ضربه بزنید، زیر میکروسکوپ اینورت نگاه کنید ۲ بار با PBS  ۰.۵cc  شستشو، و بعد تریپسین EDTA ۳۷ درجه، بعد ضربه، به محیط کشت اضافه کنید).

۷,۲- با جدا شدن سلول ها از سطح ظرف کشت، برای خنثی کردن اثر trypsin به آن ۱ cc محیط  کامل حاوی سرم اضافه کنید.

۷,۳- سپس  با توجه به مقدار نمونه، درون ظرف های دیگه اونرو  aliquot  کنید. و با توجه به نوع ظرف به آن  محیط تازه اضافه کنید و در انکوباتور ۳۷ درجه قرار دهید ( قسمت ۷,۳ فقط برای subculture دادن نمونه هاست).

۸- برای هاروست به ازای هر ۱cc حدودا ۷۵ میکرولیتر کلسمید اضافه کنید و ۴-۳ تا ساعت در ۳۷ درجه انکوبه کتید. پس از این مدت طبق قسمت شماره ۷ سلول ها را trypsinized  کرده و سوسپانسیون سلولی را در لوله جداگانه نگهداری کنید.

۹- پس از جدا شدن و جمع آوری سوسپانسیون آن را به مدت ۱۵ دقیقه با دور  ۱۰۰۰ rpm سانتریفوژ کنید.

۱۰- تو این مرحله  supernatant  را برداشته و به آن محلول هایپوتونیک ۰.۷۵ M KCI اضافه کنید  و به مدت ۱۰ دقیقه در ۳۷ درجه انکوبه کنید.

۱۱- سپس سانتریفوژ کرده و پس از حذف supernatant به اون Fix 3:1  ۵cc ( متانول ۳: اسید استیک ۱)  اضافه کرده و آن را  ۲۰ دقیقه به همین حالت قرار دهید (همان موقع هاروست کنید).

۱۲- پس از ۲۰ دقیقه، نمونه را سانتریفوژ کنید و مجددا فیکس اضافه کنید و ۲۰ دقیقه دیگه در همین حالت آن را قرار دهید. ( یا همون موقع هاروست کنید).

۱۳- سپس نمونه را سانتریفوژ و غلظت سوسپانسیون را برای لام گیری آماده کرده و از نمونه لام گیری کنید.

نکته:  مراحل ۸-۱ در شرایط استریل انجام بشه.

تذکر: پروتکل ها بر اساس set up آزمایشگاه ها متفاوت هستند.

 

انواع کشت سلولی مایع آمنیوتیک

کشت مایع آمنیوتیک – شرایط نمونه گیری و روش کار/ پروتکل