✍ پروتکل/دستورالعمل نمونه گیری و کشت مایع آمنیوتیک

جمع آوری و انتقال نمونه به آزمایشگاه

بهتر است که ۱۵-۲۰ میلی لیتر مایع آمنیوتیک در هفته ۱۷_۱۵ حاملگی، بوسیله پزشک متخصص زنان گرفته شود. سرنگ نمونه گیری باید non- toxic باشد. toxic بودن سرنگ یکی از عوامل جواب ندادن یا failure کشت است، بنابراین باید مطمئن باشیم که سرنگ و پیستون هایش non- toxic هستند. مایع در دو لوله پلاستیکی استریل تقسیم می شود که سانتریفوژ شود.

نکته مهم: اکیدا پیشنهاد می شود که انتقال سریع نمونه ها به آزمایشگاه صورت بگیرد و از قرار دادن نمونه در درجه حرارت های بالا، در حین حمل نمونه، اجتناب شود.

ترکیبات موجود در نمونه مایع آمنیوتیک

• ترکیبات سلولی

در طول مراحل اولیه حاملگی، مایع آمنیوتیک از مقدار زیادی سرم مادری و همچنین محتویات سلول های جنینی، که با افزایش سن جنین، این محتویات سلولی بیشتر می گردد، تشکیل می شود. یک جمعیت ناهمگون از سلول ها وجود دارد که شامل مایع آمنیوتیک، پوست، کانال alimentary و سیستم تنفسی و urogenital است. در مراحل بعدی حاملگی، بیشتر سلول ها قابل رشد یا قابل دوام نیستند.

از سلول های قابل رشد سه دسته سلول های تشکیل دهنده کلنی وجود دارد:

• سلول های آمنیوسیت (AF) [ که اکثریت را دارند ]
• سلول های اپیتلوئید (E)
• سلول های شبه فیبروبلاست

شرایط نمونه گیری

مایع آمنیوتیک چه رنگی است؟ مایع آمنیوتیک به رنگ زرد کمرنگ است و اغلب در مراحل بعدی حاملگی وقتی غلظت سلول ها بالاتر است، رنگ مایع کدر می شود. ظاهر ادرار می تواند شبیه مایع آمنیوتیک باشد، اگرچه به نظر کمرنگ تر می رسد. در صورتیکه مشکوک باشیم به اینکه آیا نمونه ادرار است یا خیر. تشخیص بین این دو، با استفاده تست reagent strip برای شناسایی آلبومین امکان پذیر است، که در مایع آمنیوتیک وجود دارد، ولی در ادرار وجود ندارد. نمونه می تواند با خون جنین یا مادر هم آلوده باشد. گرچه سلول های خون مادر قابلیت بالایی برای رشد در مایع آمنیوتیک ندارند، اما تست Kleihauer می تواند برای تشخیص نمونه خون جنین از مادر، اگر لازم است انجام شود.

لخته های خونی هم می تواند وجود داشته باشد که اگر کوچک باشند، می تواند برداشته و دور ریخته شوند. زمانی که لخته های بزرگتر وجود داشته باشند، می توانند با آنزیم شکسته شوند و سلول های مایع آمنیوتیک که در داخل لخته ها محبوس بودند آزاد شوند. گاهی اوقات، نمونه ها می توانند، قهوه ای یا سبز باشند، که علت آن آلودگی با خون همولیز شده کهنه است. در این حالت، بهتر است، سلول های مایع آمنیوتیک، با محیط کامل قبل از کشت شسته شوند، ولی اغلب رشد آن نسبت به نمونه های معمولی (optimum) ،مدت زمان بیشتری طول می کشد.

نکته مهم: در صورت وجود لخته خون، می توانیم لخته های خون در نمونه های مایع آمنیوتیک را، پخش آنزیمی کنیم.

شکستن لخته در مایع آمنیوتیک:

مواد و وسایل:

۱-هود لامینار کلاس ۲ (Class 2 microbiological safety cabinet)

۲- بن ماری ۳۷ درجه سانتی گراد

۳- لوله سانتریفوژ  ۱۰ml ته مخروطی

۴-پیپت پاستور شیشه ای ۱۵۰mm

۵-محلول Trypsin_Versene (TV)  استریل و گرم در ۳۷ درجه سانتی گراد

روش کار

۱- با استفاده از یک پیپت پاستور شیشه ای، لخته را از مایع آمنیوتیک بردارید و آن را در یک لوله سانتریفوژ با  ۵ml از TV گرم قرار بدهید.

۲- با ضربات و تکان های شدید به لوله، لخته شروع به شکستن می کند.

۳- به مدت ۳۰ دقیقه در بن ماری ۳۷ درجه سانتی گراد قرار بدهید، تا لخته شکسته شود.

۴- وقتی لخته خرد شد، پروتکل را ادامه بدهید

راه اندازی (setting up) – کشت سلولی مایع آمنیوتیک

پیش از ست آپ مایع آمنیوتیک در کشت، مهم است که جزئیات بیمار را چک کنید و به شرایط و حجم نمونه توجه کنید. این جزئیات می توانند روی یک کارت پر شود که بعدا برای ضبط تمام اطلاعات بعدی کشت، مورد استفاده قرار می گیرد.

انواع کشت سلولی مایع آمنیوتیک

۱– کشت های coverslip (لام)

۲- کشت با فلاسک یا در لوله