✍ پروتکل/دستوالعمل تهیه ژل آگارز و کاربرد الکتروفورز ژل آگارز 

برای مشاهده ی محصول PCR  ازالکتروفورز ژل آگارز استفاده می کنیم.

برای الکتروفورز آگارز،که نوعی از ژل الکتروفورز است، برای جداسازی اسید های نوکلئیک با اعمال کردن یک میدان الکتریکی در یک بستر ایجاد شده با استفاده از ژل آگارز مورد استفاده قرار می گیرد مولکول های آگارز با کنار هم قرار گرفتن به صورت سه بعدی منافذی ایجاد می کنند که برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک بسیار مناسب هستند . ژل آگارز به خاطر اندازه بزرگ منافذ، قدرت جداسازی و تفکیک پایین تری نسبت به اکریل آمید برای DNA دارد، اما دامنه جداسازی آن بسیار وسیع­تر است.

آگارز یک پلی ساکارید است که معمولا از برخی  جلبک های دریایی قرمز استخراج می شود. کارایی آگارز برای جداسازی ماکرومولکول ها و سوپر مولکول ها ست . این ژل را در درصدهاي مختلف تهیه مي كنند كه این مطلب به اندازه قطعه موردنظر بستگي دارد. یعني هرچه اندازة قطعه موردنظر بزرگتر باشد غلظت ژل كاهش مي یابد.

آگارز به شکل پودر سفید است که به آن آب جوش اضافه می گردد، و هنگامی که سرد می شود حالت ژله ای به خود می گیرد. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر و اسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است.

برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰جفت باز از آگارز ۳ %و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸ % درصد استفاده می شود.

اﻧﺪازه ﺣﻔﺮه ﻣﻮﺟﻮد در ژل، ﺑﺴﺘﮕﯽ ﺑﻪ ﻏﻠﻈﺖ آﮔﺎرز در ﺑﺎﻓﺮ دارد .ﻫﺮ ﺑﺎﻧﺪ ﺗﻔﮑﯿﮏ ﺷﺪه ﺣﺎوي ﭼﻨﺪﯾﻦ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻦ ﺑﺎ ﺣﺮﮐﺖ اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي ﯾﮑﺴﺎن ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ. در اﯾﻦ ﻧﻮع از ﻣﺤﯿﻄﻬﺎي اﻟﮑﺘﺮوﻓﻮرزي  ﺑﺎﻧﺪﻫﺎ ﺑﯿﺸﺘﺮ ﺑﻪ ﺻﻮرت ﭘﻬﻦ دﯾﺪه ﻣﯽﺷﻮﻧﺪ زﯾﺮا ژل آﮔﺎرز ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﻣﺤﯿﻄﻬﺎي دﯾﮕﺮ ﻣﺎﻧﻨﺪ اﺳﺘﺎت ﺳﻠﻮﻟﺰ ﻧﺴﺒﺖ ﭘﺮوﺗﺌﯿﻨﻬﺎ از ﻧﻔﻮذﭘﺬﯾﺮي ﺑﺎﻻﯾﯽ ﺑﺮﺧﻮردار ﻣﯽﺑﺎﺷﺪ.

تهیه ژل آگارز

1. قالب ژل را آماده کنید
2. شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قراردهید
3. حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید (اندازه گیری طول و عرض قالب و قطر ژل مورد نظر)
4. پودر آگارز را وزن کنید.
5. آگارز را در بافر ۱xTBE حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر ۱۰ میلی لیترژل یک میکرولیتر از محلولmg/ml 10 اتیدیوم بروماید اضافه کنید سپس آن را مخلوط کرده و داخل قالب بریزید
6. بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید

ژل آگارز را می شود با حل کردن پودر آگارز در بافر مناسب ( TAE یا TBE) آماده کرد. در ابتدا پودر آگارز  در بافر مورد نظر حل می ­شود و بعد تقریبا تا دمای جوش گرم می شود، اما باید دقت کرد که نجوشد. آگارز ذوب شده را قبل از ریختن در ژل تری به خوبی سرد کرده. اگر دمای آن خیلی بالا باشد، ممکن است تری ژل سوراخ شود. شانه را قبل از ریختن آگارز ذوب شده در تری قرار داده تا به خوبی چاهک های مخصوص بارگیری نمونه تشکیل بشوند. غلظت ژل ۱ ٪ معمولا برای یک عمل الکتروفورز روتین تهیه می شود.

وقتی که ژل بسته شد، شانه را از آن بیرون آورده حالا می­ شود با قرار دادن آن در محفظه تانک و ریختن بافر تازه به اندازه کافی نمونه ها را بارگذاری کرد. باید دقت کرد که قبل از بارگذاری نمونه ­ها، آنها را با بافر Loading  مخلوط نمود تا به راحتی در چاهک ها قرار بگیرند. معمولا بافر loading از یک ترکیب با چگالی بالا مانند گلیسروله که چگالی کلی نمونه ها را بالا می بره و نمونه DNA به راحتی در ته چاهک قرار می گیرد. بافر Loading همچنین دارای رنگ­هایی مثل، زایلن سیانول و بروموفنول بلو است که این رنگ ها به برای نشان دادن میزان پیشرفت نمونه ها بر روی ژل مورد استفاده قرار می گیرند. حالا نمونه های   DNAرا با استفاده از سمپلر بارگذاری می کنیم. ژل الکتروفورز آگارز معمولا در تانک الکتروفورز افقی ران می شود و در حین عمل الکتروفورز ژل کاملا در بافر غوطه ور می شود.

باید دقت شد که ولتاژ بالاتر باعث جداسازی سریع­تر نمونه ها می شود، اما موجب ذوب شدن ژل و بافر می شود وباعث می شود جداسازی نمونه ها با کیفیت خوبی صورت نگیرد. ولتاژ پایین هم می تونه موجب پهن شدن باندها برای قطعات کوچک DNA شود. به خاطر اینکه مولکول DNA در نور معمولی قابل مشاهده نیست، همراه آنها رنگ­هایی نیز بارگذاری ­می شود زایلن سیانول (آبی کم رنگ) به همراه مولکول های بزرگ DNA حرکت می کنند ، اما بروموفنل بلو (آبی تیره) همراه با قطعات کوچک تر DNA حرکت می کنند.

حین بارگزاری نمونه ها یک مارکر DNA هم در چاهک جداگانه ای بارگزاری می شود. این مارکر دارای قطعاتی از مولکول DNA با وزن های مشخصه که برای تخمین وزن مولکول های DNA مورد استفاده قرار می گیرند.

مولکول های اسید نوکلئیک با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی می شوند این رنگ با قرار گرفتن در شیار بزرگ DNA می­تونه زیر نور UV فلوئورسانس ساطع کند و با استفاده از دستگاه ژل داک مشاهده شه ولی خطرناک است و سرطانزاس برای همین رنگ های دیگه ای مثل ژل رد و محصولات تجاری مشابه مثل Green viewer   و safe stain به عنوان جایگزین­های سالم­تر از اتیدیوم بروماید مورد استفاده قرار می­ گیرند. بعد از تمام شدن آزمایش ژلی را که تهیه کرده ایم می شود در یک نایلون قرار داد و در یخچال نگهداری کرد.

تکنیک الکتروفورز – بخش اول

تکنیک الکتروفورز – بخش دوم