✍ بررسی CT و خط آستانه(threshold) در آزمایش real-time PCR

مرحله مهم در RealTime PCR که در طول این مرحله تعیین مقدار DNA هدف امکانپذیر است کدام مرحله است و مهم ترین اصطلاح در این نوع PCRچیست؟

مرحله ی نمایی یا Exponential phase مرحله مهم در RealTime PCR که در طول این مرحله تعیین مقدار DNA هدف امکانپذیر است مهم ترین اصطلاح در این نوع PCR اصطلاح threshold و یا CT است که سیکلی از PCR می باشد که میزان فلوئورسانت محصول از حد آستانه ی انتخابی ما در بالای فلورسنس پس زمینه بالاتر می رود که در این نقطه فاز نمایی آغاز می شود .

روشن است که در PCR اگر تمام شرایط برابر باشد و مهار کننده ای وجود نداشته باشد هر چه میزان نوکلئیک اسید اولیه به عنوان الگو بیشتر باشد میزان محصول و سرعت تشخیص آن ها نیز افزایش می یابد. پس در نتیجه هر چقدر میزان الگو اولیه بیشتر باشد زودتر به حد آستانه خواهیم رسید و CT کمتر خواهد شد. در یک واکنش RealTime PCR با بازده ۱۰۰٪ میزان محصولات در هر چرخه دو برابر می‌شود.

به این ترتیب می‌توان این رابطه را نوشت : Δ CT= ۲-ΔCT fold differences که یعنی هر یک عدد کاهش در CT یعنی تعداد مولکول های آغازگر دو برابر و هر ۲ عدد کاهش یعنی تعداد مولکول های هدف ۴ برابر است و به همین ترتیب ادامه خواهد داشت . مقدار CT توسط نرم افزار دستگاه RealTime به صورت اتوماتیک به ما داده می شود ولی خودمان نیز به صورت دستی و با تعیین خط آستانه می توانیم آن را بررسی کنیم. به خاطر خطاهای متعددی که حین پروسه انجام RealTime PCR رخ می دهد نظیر خطا در پیپت‌ کردن مواد واکنش و یا بازده و کارایی متفاوت PCR و یا حتی خطا دستگاه Real-time PCR و …که می تواند باعث ایجاد تغییر در نتایج (variability ) شود.
علاوه بر آن ناپایداری (instability) مواد اولیه هم می‌توانند باعث ایجاد نتایجی متغیر شوند. در نتیجه Real-time PCR، به استفاده گسترده از کنترل‌هایی نیازمند است که برای پی بردن به درستی نتایج حاصل‌شده به کار می روند.

یک واکنش RealTime PCR دارای چندین کنترل است:

کنترل بدون الگو یا no-template control (NTC):
در این حالت تمامی پرایمرها، پروب‌ها و مواد مورد نیاز جهت انجام Real-time PCR حضور دارند، ولی فقط DNA اولیه الگو نداریم. جهت بررسی تشکیل سیگنال و یا عدم تشکیل آن در غیاب نوکلئیک‌اسید هدف از NTC استفاده می کنیم. این کنترل قادر است که آلودگی و هرنوع فعل‌ و انفعال پرایمرها و پروب‌ها را که منجر به خدشه دارشدن نتایج شود، شناسایی کند.

کنترل خارجی (exogenous): یک قطعه DNA یا RNA سنتزشده است که با غلظت معینی در مخلوط واکنش قرار دارد. این کنترل می‌تواند به عنوان کنترل مثبت داخلی (Internal Positive Control= IPC) عمل کرده و مهار PCR و یک واکنش منفی حقیقی را از هم مجزا ند ؛ به این ترتیب که قطعه موردنظر را به همراه پرایمر مخصوصش به مخلوط واکنش اضافه می‌کنیم. اگر شرایط استاندارد باشد و واکنش درست انجام شود، باید هم این قطعه و هم توالی هدف Real-time PCR هر دو تکثیر شوند. درصورتیکه خود Real-time PCR نتیجه ندهد اما قطعه افزوده‌شده تکثیر شود، واکنش منفی حقیقی رخ داده است و از دلایل آن می‌توان به عدم حضور توالی هدف Real-time PCR اشاره کرد. اگر هر دو قطعه تکثیر نشوند، PCR مهار شده است.

کنترل داخلی (endogenous control): این کنترل نوکلئیک‌اسیدی است که در مخلوط دارای DNA هدف وجود دارد و درصورت استفاده از پرایمرها و پروب‌های مناسب، می‌‌تواند در آزمایش Real-time PCR تشخیص داده شود. این قطعه که به آن active reference هم گفته می شود جهت نرمالیزه‌ کردن تفاوت‌هایی که در مقدار کل DNA اولیه‌ اضافه‌شده به آزمایش‌های PCR وجود دارد، به کار می رود. ژن‌های housekeeping نظیر β-actin، GAPDH (glyceraldehyde 3-phospahte dehydrogenase) و ۱۸S RNA که همواره وجود داشته و همیشه به یک میزان توسط سلول ها بیان ‌می شوند و جهت تداوم بقای سلول و انجام فرایندهای حیاتی ضروری اند در بررسی بیان ژن توسط RealTime PCR کاربرد فراوانی دارند .

 تکنیک/روش RealTime PCR – بخش اول (انواع روشهای آزمایش)

تکنیک Real-Time PCR – بخش دوم (منحنی تکثیر محصولات)

تکنیک RealTime PCR – بخش سوم (مراحل انجام واکنش)

تکنیک Real time PCR – بخش چهارم(چرخه انجام واکنش)

تکینک RealTime PCR – بخش پنجم(اشکالات منحنی تکثیر -۱)

تکینک RealTime PCR -بخش ششم(اشکالات منحنی تکثیر-۲)