✍ انواع دیگر وکتورهای کلونینگ مخمر و استفاده از کروموزوم های مصنوعی برای کلون کردن قطعات بزرگ DNA در مخمر

علاوه بر yep  ها  چندیدن نوع دیگر از وکتور های کلونینگ جهت استفاده در ساکاروماسیس سرویزیه وجود دارند . 

‍ ‍‍پلاسمید های الحاقی مخمر :(yips) اساسا پلاسمید های باکتریایی هستند که حامل یک ژن مخمری می باشند. به عنوان مثال می توانYIps  را نام برد که یه پلاسمید Pbr322 دربردارنده یک ژن URA3 می باشد. این ژن آنزیم اوروتیدین ۵-فسفات دکربوکسیلاز را کد می کند (آنزیمی که یکی از مراحل بیوسنتز نوکلئوتید های پیریمیدینی را کاتالیز می کند) و به عنوان مارکر انتخابگر دقیقا به روش مشابهی با   LEU2  مورد استفاده قرار می گیرد . Yip  مانند یک پلاسمید قادر به همانندسازی نیست، چون دارای هیچ قسمتی از پلاسمید ۲ um نمی باشد به طوری که برای بقای خودش وابسته به الحاقش به داخل DNA  کروموزومی مخمر است. الحاق به کروموزوم درست مثل آنچه در مورد Yep توضیح داده شد، انجام می شود .

پلاسمید های تکثیرشونده مخمر (YRpS)  قادرند همانند پلاسمید های مستقل تکثیر شوند، به این دلیل که آن ها توالی DNA کروموزومی که حاوی مبدا همانندسازی می باشد را حمل می کنند. مشخص شده است که مبداهای همانندسازی در نزدیکی چندین ژن مخمر قرار گرفته اند که از جمله آن ها می توان به یک یا دو ژن اشاره کرد که می توانند به عنوان مارکر های انتخابگر مورد استفاده قرار گیرند. وکتور  YRP7 یک نمونه از پلاسمید های تکثیرشونده است . این وکتور از پلاسمید PBR322  به علاوه ژن TRp1  مخمر ساخته شده است. این ژن که در بیوسنتز تریپتوفان نقش دارد در نزدیکی مبدا همانندسازی واقع شده است. قطعه DNA  مخمر که  YRPوجود دارد حاوی هم ژن TRP  و هم مبدا همانندسازی است .

سه عامل در تصمیم گیری جهت انتخاب وکتور مناسب برای کلونینگ ژن ها در مخمر نقش بازی می کنند. اولین عامل فراوانی ترانفورماسیون است که مقیاس آن تعداد سلول های ترانسفورم شده می باشد که می تواند به ازای هر میکروگرم از  DNA پلاسمید بدست آید. اگر مقدار DNA اولیه کم باشد یا نوترکیب های زیادی لازم باشد، فراوانی ترانسفورماسیون بالایی مورد نیاز است . YEP ها دارای بالاترین توانایی ترانسفورماسیون هستند که بین هزار تا صد هزار ترانسفورم شده را به ازای هر میکروگرم DNA فراهم می کنند . YRP ها نیز خیلی مولد و پربازده هستند به طوری که هزار تا ده هزار سلول ترانسفورم شده را به ازای هر میکروگرم DNA تولید می کنند، اما بازده YIP کمتر از هزار است و فقط ۱۰-۱ سلول ترانسفورم شده به ازای هر میکروگرم حاصل می شود، مگر اینکه روش خاصی به کار گرفته شده باشد . پایین بودن فراوانی ترانسفورماسیون YIP نشان دهنده این واقعیت است که قبل از ماندگاری وکتور در داخل مخمر ، پدیده نسبتا نادر الحاق به داخل کروموزوم لازم است .

دومین عامل مهم تعداد کپی می باشد . YEP ها و YRP ها بیشترین تعداد کپی را دارا هستند که به ترتیب دارای ۵۰-۲۰ و ۱۰۰-۵ کپی می باشند . بر خلاف آن ها از YIP تقریبا یک کپی در هر سلول حضور دارد. این دو عامل ، چنانچه هدف به دست آوردن پروتئین از ژن های کلون شده باشد مهم هستند، چرا که هر چه تعداد کپی ها از ژن مورد نظر بیشتر باشد میزان بازده فراوانی پروتئینی قابل انتظار نیز بیشتر خواهد بود .

چرا تمایل به استفاده از YIP ها وجود دارد؟ جواب این است که این وکتور ها ، نوترکیب های بسیار پایداری ایجاد می کنند به طوری که از دست رفتن YIP هایی که به داخل کروموزوم وارد شده اند به مقدار خیلی کمی اتفاق می افتد. برعکس، نوترکیب های YRP بسیار ناپایدار هستند، به طوری که در هنگام جوانه سازی سلول های دختری، پلاسمید ها تمایل به تجمع در سلول مادری دارند که این باعث غیرنوترکیب شدن سلول دختری می شود. نوترکیب های YEP از مشکلات مشابهی رنج می برند، اگر چه فهم ما از بیولوژی پلاسمید ۲ UM در سال های اخیر باعث ایجاد YEP های پایدارتری شده است. با این وجود، چنانچه هدف از آزمایشات ایجاد سلول های مخمر نوترکیبی باشد که بایستی ژن کلون شده را برای مدت طولانی در خود نگه دارد ، YIP وکتور انتخابی است .

کروموزوم های مصنوعی می توانند برای کلون کردن قطعات بزرگ DNA در مخمر استفاده شوند

آخرین نوع وکتور های کلونینگ در مخمر که مدنظر قرار میگیرند، کروموزوم مصنوعی مخمر YAC است که رویکردی کاملا متفاوت را در کلونینگ نشان می دهد. ساخت YAC ها نتیجه جانبی تحقیقات بنیادی بود که روی ساختمان کروموزومی انجام شد، کاری که منجر به شناخت اجزای کلیدی کروموزوم شد.

سانترومر که در طول تقسیم سلول برای توزیع صحیح کروموزوم ها به سلول های دختری، مورد نیاز است .

دو تلومر، ساختار هایی در انتهای کروموزوم که برای همانندسازی صحیح انتهاها و جلوگیری از خورده شدن توسط اگزونوکلئازها ضروری هستند .

مبدا همانند سازی ، محل هایی در طول کروموزوم هستند که همانندسازی DNA از آن ها شروع می شود و مشابه مبدا همانندسازی پلاسمید هستند .

وقتی که ساختمان کروموزوم با این روش شناخته شد، این امکان حاصل شد که بتوان با روش های نوترکیبی DNA ،اجزای مجزای کروموزوم را جدا کرده و سپس با اتصال مجدد آن ها در لوله آزمایش یک کروموزوم مصنوعی ساخت. از آنجا که مولکول های DNA موجود در کروموزوم طبیعی مخمر طولی معادل چند صد کیلوباز دارند، این امکان حاصل شد که بتوان قطعات بلندی از DNA را در کروموزوم مصنوعی مخمر کلون کرد .

ساختار و نحوه استفاده از یک وکتور YAC

چندین وکتور YAC به وجود آمده اند که هر یک به روش مشابهی ساخته شده اند و یک نمونه بارز از آن ها PYAC3 است. در نگاه اول PYAC3 شباهت زیادی به یک کروموزوم مصنوعی ندارد، ولی با بررسی بیشتر، ویژگی های منحصر به فرد آن آشکار می گردد. PYAC3 اساسا یک پلاسمید PBR322 است که چندین ژن مخمر به درون آن ملحق شده است. دوتا از این ژن ها یعنی URA و TIP به ترتیب عنوان مارکر انتخابگر YRP و YIP معرفی شده اند. همانند YRP ، قطعه DNAای که TRP را حمل می کند مبدا همانندسازی را نیز شامل می شود، اما در PYAC3 این قطعه تا جایی گسترش می یابد که توالی CEN4، منطقه سانترومری کروموزوم ۴ مخمر را در بر می گیرد. قطعه TRP1-ORIGIN-CEN4  شامل دو جز از سه جز کروموزوم مصنوعی است . جز سوم یا تلومر ها توسط دو توالی که TEL نامیده می شوند فراهم می گردند. این دو توالی کامل نیستند ولی در هسته مخمر به عنوان توالی های مرکزی عمل می کنند که تلومر ها از روی آن ساخته خواهند شد. یک قسمت باقیمانده دیگر PUAC3 که هنوز به آن اشاره نشده است ، SUP4 است که مارکرهای انتخابگر را شامل می شود و DNA جدید در طول آزمایش کلونینگ به آن ملحق می شود.

روش کلونینگ با PYAC3 

ابتدا وکتور با ترکیبی از آنزیم های محدودالاثر BamHI و SnaBI به سه قسمت بریده می شود. قطعه با دو انتهای BamHI کنار گذاشته می شود، دو بازو باقی می ماند که هر کدام دارای یک توالی TEL و یک جایگاه SnaBI است . DNAای که قرار است کلون شود باید دارای انتهاهای صاف باشد (SNABI یه برش دهنده صاف است که توالی TACGTA را مورد شناسایی قرار می دهد) که با اتصال به بین دو بازو نهایتا یک کروموزوم مصنوعی ساخته می شود. برای ورود کروموزوم مصنوعی به داخل ساکارومایسس سرویزیه از روش ترانسفورم کردن به پروتوپلاست استفاده می شود. سویه مخمر مورد استفاده، جهش یافته دوگانه اگزوتروف URA3TRP می باشد که به وسیله دو مارکر واقع در کروموزوم مصنوعی به URA3TRP تبدیل  می شود.

سلول های ترانسفورم شده با کشت روی محیط حداقل کشت داده می شوند، به طوری که تنها سلول های حاوی کروموزوم مصنوعی که به طرز صحیحی ساخته شده اند قادر به رشد بوده و انتخاب می گردند. سلول هایی که با کروموزوم مصنوعی ناصحیح ترانسفورم شده اند به جای یک بازوی چپ و یک بازوی راست از هر کدام دارای دوبازو هستند که این سلول ها قادر به رشد بر روی محیط کشت حداقل نیستند، چون که فاقد یکی از دو مارکر می باشند. به منظور بررسی وجود DNA الحاقی در وکتور می توان از روش الحاق غیرفعال کننده SUP4 استفاده کرد که با یک آزمون ساده رنگی انجام می شود، به طوری که کلون های سفید رنگ سلول های نوترکیب و کلونی های قرمز رنگ سلول های غیر نوترکیب هستند.

کاربرد وکتور های YAC :محرک اولیه جهت طراحی کروموزوم های مصنوعی مخمر، متخصصان ژنتیک بودند که می خواستند از کروموزوم های مصنوعی جهت بررسی جنبه های گوناگون ساختمان و رفتار کروموزوم، مثل بررسی جدا شدن کروموزوم ها در طی تقسیم میوز ، استفاده کنند. این آزمایشات تصدیق کردند که کروموزوم های مصنوعی در طول تکثیر پایدار هستند و این احتمال بالا رفت که کروموزوم های مصنوعی می توانند به عنوان وکتور برای ژن هایی که به خاطر طول زیادشان قادر به ورود به صورت یک قطعه منفرد به وکتور E.COLI نیستند مورد استفاده قرار بگیرند . چندین ژن مهم در پستانداران دارای طولی بیش از ۱۰۰ کیلوباز هستند(برای مثال، ژن فیبروز سیستیک انسانی ۱۲۰ KB می باشد)که بیش از ظرفیت تمام وکتور های E.COLI، به جز سیستم های کلونینگ بسیار پیشرفته E.COLI است ولی به خوبی در دامنه وکتور YAC قرار می گیرند. بنابراین کروموزوم های مصنوعی مخمر راه را برای مطالعه عملکرد و نحوه بیان ژن هایی که در گذشته امکان مطالعه آن ها به روش تکنیک DNA نوترکیب وجود نداشت، باز کرد. با کشف اینکه تحت بعضی شرایط YAC ها قادرند در سلول های پستانداران تکثیر یابند، ابعاد جدیدی از این آزمایشات فراهم گردید که ما را قادر می سازد تا بررسی عملکرد ژن را در موجودی که به طور طبیعی دارای همان ژن است انجام دهیم .

کروموزوم های مصنوعی مخمر در تولید کتابخانه های ژنی هم اهمیت دارند. به خاطر بیاورید که حداکثر طول قطعات ورودی در بزرگترین وکتور E.COLI در حدود ۳۰۰KB است، که در این صورت برای ایجاد کتابخانه ژنی انسان حدود سی هزار کلون لازم است، اما وکتور های YAC معمولا برای کلون کردن قطعات ۶۰۰KB مورد استفاده قرار می گیرند و انواع خاصی قادر به کلون کردن قطعات DNA تا طولی معادل ۱۴۰۰ کیلوباز نیز می باشند، که تعداد کلون های لازم برای تهیه کتابخانه ژنی انسان را به ۶۵۰۰ کلون کاهش می دهند. متاسفانه MEGA-YAC با مشکل پایداری قطعه ورودی مواجه هستند که DNA کلون شده گاهی اوقات توسط نوترکیبی های داخل مولکولی دچار نوآرایی می شود. با این وجود YAC ها در فراهم کردن قطعات بزرگ DNA کلون شده برای استفاده در پروژه های توالی یابی DNA در مقیاس بزرگ ، ارزش زیادی دارند .

وکتورهایی برای سایر مخمر ها و قارچ ها

جهت انجام مطالعات پایه ای بیولوژی مولکولی در ارگانیسم هایی مثل مخمر و قارچ و گسترش کاربرد های احتمالی آن ها در بیوتکنولوژی، دسترسی به وکتور های کلونینگ برای دیگر گونه های مخمر ها و قارچ ها مورد نیاز است. پلاسمید های اپی زومال مبتنی بر پلاسمید ۲um ساکارومایسس سرویزیه، در انواع محدودی از سایر مخمر ها قادر به همانند سازی هستند، اما دامنه این گونه ها به اندازه کافی وسیع نیست، برای اینکه وکتور های ۲UM کاربرد عمومی پیدا کنند . در هر مورد، فراهم شدن نیاز های بیوتکنولوژی به وسیله پلاسمید های الحاقی، مثل YIP ها ، که با ایجاد سویه های نوترکیب پایدار قادر به رشد طولانی مدت در بیوراکتور هستند صورت می گیرد . هم اکنون برای تعداد زیادی از گونه ها، وکتور های الحاقی موثری در دسترس است که شامل مخمر هایی مثل پیکیاپاستوریس ، کلوودومایسس لاکتیس و قارچ های رشته ای آسپرژیلوس نیدولانس و نوروسپراکراسا می باشد.

 وکتورهای کلونینگ برای یوکاریوت ها – بخش اول (پلاسمید های الحاقی و پلاسمیدهای تکثیر شونده مخمر)

وکتورهای کلونینگ برای یوکاریوت ها – بخش دوم (وکتورهای کلونینگ مخمر و استفاده از کروموزوم های مصنوعی)

وکتورهای کلونینگ برای یوکاریوت ها – بخش سوم  (وکتورهای کلونینگ برای گیاهان عالی)