✍ بررسی ساختار اسپور و روش رنگ آمیزی اسپور

برخی از باکتری ها قادرند با تشکیل ساختار های مقاوم بنام اندوسپور شرایط سخت محیطی را تحمل کنند و در شرایط مناسب مجددا به فرم رویشی تبدیل بشوند. تولید اسپور در واقع یک نوع تمایز سلولی است زیرا که در این فرایند آنزیم ها و ساختمان های جدید جایگزین آنزیم ها و ساختمان های قبلی می شوند، بطوریکه آنتی ژن های مخصوص در مرحله اسپورولاسیون تولید می شود در حالی که در مرحله فعال باکتری وجود ندارد. شرایط تغذیه ای نامناسب از جمله؛ تخلیه منابع کربن و نیتروژن مهمترین عوامل تولید اسپور می باشند، همچنین کمبود مواد انرژی زا، سولفات، فسفات و آهن تشکیل اسپور را تحریک می کنند.

اسپور یا اندوسپور در واقع مرحله استراحت و شکل مقاوم باکتری می باشد. همه باکتری ها قادر به تولید اسپور نیستند. باسیلوس ها و کلستریدیوم ها دو جنس مهم باکتریایی تولید کننده اسپور می باشند. سایر گونه های اسپور زا مثل: اسپوروسارسینا و کوکسیلابورنتی هستند.

در فرآیند اسپورولاسیون، هر باکتری فقط یک اسپور می سازد و از هر اسپور تنها یک باکتری بوجود می آید، بنابراین تولید اسپور در باکتری ها بعنوان یک فرآیند تکثیری به شمار نمی رود. در هر باکتری اسپوردار؛ شکل، اندازه و محل استقرار اسپور ویژگی ثابتی می باشد و این خصوصیات می تواند بعنوان کلید تشخیصی در شناسایی باکتری های اسپور زا و در آزمایشگاه بالینی مورد استفاده قرار گیرند.

به طور کلی موقعیت قرار گرفتن اسپور در سلول مادر به سه حالت؛ مرکزی(Central) ، انتهایی(Terminal)  و نزدیک انتهایی(Subterminal) می باشد و شکل اسپورهم به صورت کروی (Spherical) و بیضی(Oval) مشاهده می شود. اندازه اسپور کلستریدیم ها بزرگتر از سلول والد بوده و موجب تورم و تغییر شکل سلول مادر می شود ولی اندازه اسپور در جنس باسیلوس ها کوچکتر از سلول والد می باشد.

ساختمان اسپور

Core: پروتوپلاست اسپور است که حاوی یک هسته کامل ( کروموزوم) و تمام اجزاء سیستم تولید پروتئین و یک سیستم تولید انرژی از طریق گلیکولیز می باشد. انرژی مورد نیاز اسپور بیشتر بصورت ۳-فسفوگلیسرات ذخیره می شود.

Inner membrane: داخلی ترین لایه اطراف اسپور را تشکیل می دهد.

Germ cell wall: دیواره اسپور، غشاء داخلی اسپور را احاطه می کند. این دیواره از پپتید وگلیکان معمولی تشکیل شده و دیواره سلولی باکتری فعال و زایای بعدی را تشکیل می دهد.

Cortex: کورتکس ضخیم ترین لایه پوشش اسپور است. این لایه از نوعی پپتید وگلیکان غیر معمول ساخته شده است که تعداد پل های عرضی آن از پپتید وگلیکان دیواره سلولی بسیار کمتر است. این لایه به شدت نسبت به لیزوزیم حساس بوده و اتولیز آن در زایا شدن نقش دارد.

Outer membrane: این لایه از یک پروتئین شبه کراتینی با  پیوند های دی سولفیدی زیاد ساخته شده است. مقاومت نسبی اسپور در برابر عوامل شیمیایی مربوط به نفوذ ناپذیری این لایه می باشد.

Exosporium: اگزواسپور خارجی ترین لایه بوده و از جنس لیپوپروتئین است.

زایش اسپور( Germination)

این فرایند شامل ۳ مرحله است: مرحله فعال سازی، آغازین، رشد خارجی

۱.مرحله فعال سازی: تعداد زیادی از اندوسپور ها بلافاصله پس از تشکیل قادر به زایش نیستند، اما پس از چند روز استراحت در یک محیط غنی زایا می شوند.از بین عواملی که قادرند حالت استراحت اسپور را خاتمه دهند، می توان به گرما، خراشیدگی پوشش اسپور،اسیدی بودن محیط و ترکیبات حاوی گروه های سولفیدریل اشاره کرد.

۲.مرحله آغازین: در این مرحله گیرنده ها و حسگر های اسپور حضور مواد خاصی را در محیط شناسایی کرده و به عنوان غنی بودن محیط تشخیص می دهند، سپس روند اتولیز پپتیدوگلیکان کورتکس فعال می شود. آب جذب شده و کلسیم دی پیکولینات رها می شود و اجزای اسپور توسط آنزیم های هیدرولیز کننده تخریب می شوند.

۳.مرحله رشد خارجی: تخریب کورتکس و لایه های خارجی منجر به خروج یک سلول فعال جدید از اسپور می شود، سپس این سلول رشد کرده و تکثیر می یابد.

مقاومت اسپور

همانطور که اشاره شد، اندوسپور در مقابل شرایط نامساعد از جمله؛ حرارت، سرما، خشکی، مواد شیمیایی، تشعشعات و غیره، مقاوم است. اسپور قادر است حرارت ۱۰۰ درجه سانتی گراد را چندین ساعت تحمل کند، بنابراین برای از بین بردن اسپور حرارت مرطوب ۱۲۰ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ تا ۲۰ دقیقه اعمال می شود.

برخی منابع مقاومت اسپور را به دو عامل نسبت می دهند:

1. وضعیت دهیدراته بودن اسپور
2. وجود مقادیر زیاد کلسیم دی پیکولینات

ولی به طور عمده علت مقاوم بودن اسپور را به ضخامت جداره، نفوذ ناپذیری، کم بودن فعالیت متابولیکی و کم بودن آب آن نسبت می دهند.

رنگ آمیزی اندوسپور

اندوسپور به دلیل نفوذ ناپذیر بودن به آسانی رنگ نمی گیرد و در صورت رنگ پذیری به آسانی رنگ خود را از دست نمی دهد. این خاصیت اساس و پایه رنگ آمیزی اسپور را تشکیل می دهد. اسپور به وسیله رنگ مالاشیت گرین و با کمک حرارت رنگ آمیزی می شود، سپس سافرانین به عنوان رنگ مکمل در این تکنیک مورد استفاده قرار می گیرد. در  این روش باکتری ها قرمز رنگ و اندوسپور ها به رنگ سبز در داخل پیکر باکتری والد مشاهده می شوند.

اگر باکتری اسپور دار به روش گرم رنگ آمیزی شود اندوسپور ها به صورت مناطق شفافی قابل مشاهده خواهند بود. همچنین اندوسپور را می توان به علت شفافیت با میکروسکوپ  فازکنتراست مشاهده کرد.

روش رنگ آمیزی

۱- یک گسترش از باکتری مورد نظرمون رو روی اسلاید می گذاریم

۲- ابتدا اجازه می دهیم اسلاید در دمای آزمایشگاه  خشک شود

۳- اسلاید را ۳ مرتبه روی شعله عبور داده و به کمک حرارت تثبیت می کنیم

۴- یک تکه کاغذ صافی بر روی لام قرار می دهیم و با گیره مخصوص اسلاید را نگه می داریم

۵- روی کاغذ صافی و اسلاید را با مالاشیت گرین می پوشانیم و بر روی شعله می گیریم و اجازه می دهیم تا رنگ تبخیر شود. این کار را به مدت ۵ دقیقه ادامه می دهیم (رنگ نباید بجوشد و اگر خشک شود سریعا مقدار کمی رنگ به آن اضافه می کنیم)

۶- اجازه می دهیم اسلاید سرد شود، سپس کافیه کاغذ صافی را برداریم و به مدت ۳۰ ثانیه با آب شستشو دهیم

۷- سطح لام را با سافرانین به مدت ۶۰ تا ۹۰ ثانیه می پوشانیم

۸- اسلاید را به آرامی با آب می شوییم

۹- در نهایت اسلاید را خشک کرده و با عدسی ۱۰۰X و روغن آن را مشاهده می کنیم

تکنیک رنگ آمیزی گرم

تکنیک رنگ آمیزی اسید فاست در باکتری

دستورالعمل رنگ آمیزی اسپور باکتری

تکنیک رنگ آمیزی کپسول و رنگ آمیزی باکتری گرم منفی