✍ هاروست (برداشت)مرحله دوم از آزمایش کاریوتایپ خون

هاروست(برداشت) سلول ها یعنی جمع آوری سلول های در حال تقسیم در مرحله متافاز، تیمار با محلول هایپوتونیک، تثبیت و قرار دادن کروموزوم ها روی اسلاید شیشه ای.

مرحله انجام هاروست شامل دو گام است. گام اول باید میتوز را متوقف کنیم و گام دوم از بین بردن RBC و تورژسانس سلول های دیگر مثل TCell ها با استفاده از محلول هایپوتونیک است.

همانطور که گفتیم، بعد از ۶۸ تا ۷۲ ساعت که نمونه خون در انکوباتور قرار گرفت و سلول ها رشد کردند، تعداد کافی سلول درحال تقسیم بدست می آید، سپس این سلول ها جمع آوری می شوند .نکته ای باید بدانیم، این است که مراحل اصلی برداشت سلولی برای انواع سلول ها با کمی اختلاف مشابه هستند. برای اینکه میزان کافی از سلول ها را در مرحله متافاز داشته باشیم، به یک مهار کننده میتوزی نیاز داریم به نام کلسمید.

• کلسمید، آنالوگ کلشی سین که در اکثر آزمایشگاه های سیتوژنتیکی به عنوان مهار کننده از آن استفاده می کنند.

 دستورالعمل /مراحل انجام آزمایش برداشت( هاروست):

۱-ابتدا ۱۰۰ لامبدا کلسمید با غلظت ۱۰µg/mlبه ۵cc کشت اضافه کنید. در بعضی مواقع  ۱۰۰ لامبدا اتیدیوم بروماید نیز اضافه کرده و در ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه نمایید (High Resolution).

نحوه عمل کلسمید

کلسمید به پروتئین توبولین متصل می شود و از تشکیل رشته های دوک جلوگیری می کند و رشته هایی که وجود دارند هم تخریب می کند و با این کار مانع جدا شدن کروماتیدهای خواهری درمرحله آنافاز چرخه سلولی می شود، بنابراین سلول ها در مرحله متافاز باقی می مانند.

تذکر: زمان اثر کلسمید بسته به نوع نمونه متفاوت است.

زمان اثر کلسمید باید با توجه به کیفیت و کمیت نتیجه تعیین می شود. مدت زمان طولانی تر باعث جمع آوری تعداد سلول های متافازی بیشتری می شود، اما به دلیل اینکه کروموزوم ها در مرحله متافاز متراکم می شوند طول کروموزوم ها کوتاهتر می شود، اما معمولا در مطالعات سیتوژنتیک کروموزوم های طویل تر ارجحیت دارند.

۲- در این قسمت از کار، لوله کشت را ۳۰-۲۰دقیقه بعد، با دور ۱۰۰۰ rpm به مدت ۱۵-۱۰دقیقه سانتریفوژ کنید.

۳-بعد از سانتریفوژ، محلول رویی را به آرامی خالی کرده ( دکانته کرده) و رسوب را به کمک ورتکس یا دست، بهم بزنید.

۴- مرحله مقدر ۵cc محلول هابپوتونیک کلرور پتاسیم (  ۰.۷۵Mیا ۵/۶g /lit)گرم شده در ۳۷ درجه سانتی گراد را به آرامی اضافه کنید.

نقش محلول هایپوتونیک مرحله برداشت:

 بعد از کلسمید یک محلول هیپوتونیک به سلول ها اضافه می شود. همانطور که می دانید محلول هیپوتونیک غلظت نمکی کمتر از  سیتوپلاسم (خون) دارد بنابراین طبق پدیده اسمز باعث حرکت آب از خارج به داخل سلولها (گلبول های قرمز) می شود و گلبول های های قرمز خون متورم می شوند. محلول هایپوتونیک در واقع باعث همولیز گلبول قرمز خون شده، که این امر برای پراکنده شدن کروموزوم ها روی لام میکروسکوپ ضروری است. نکته خیلی مهم که باید بدانیم، این است که اگر سلول ها زمان زیادی در محلول هیپوتونیک قرار بگیرند پاره شده و در زمان خیلی کوتاه هم سلول ها به میزان کافی متورم نشده و بنابراین کروموزوم ها از هم جدا نمی شوند.

۵- محتوی لوله را چند بار به آرامی مخلوط کرده و لوله را به صورت عمودی در اتو  ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید. ( محلول هایپوتوتیک کلرورپتاسیم  را در دو  لوله اضافه کرده، و یک لوله را به مدت ۱۲ دقیقه، و لوله دیگر را به مدت ۱۵ دقیقه در اتو قرار می دهیم).

۶-لوله را به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۸۰۰ rpm سانتریفوژ کنید.

۷-و سپس محلول رویی را خالی کنید یا با پیپت بر دارید و رسوب را با اضافه کردن فیکس تازه، به آرامی با دست یا ورتکس، بهم بزنید.

۸- در مرحله فیکس کردن باید سلول کشته شده و ساختارهای درونی بدون آسیب تثبیت شوند که برای این کار از محلول فیکساتیو استفاده می شود. این محلول از سه بخش متانول و یک بخش اسید استیک تشکیل شده. در این مرحله ابتدا ۲ ml  فیکساتیو تازه با پیپت قطره قطره اضافه می کنیم، به صورتی که هیچ لخته ای وجود نداشته باشد. سپس۳ ml  فیکس بعدی را به آرامی اضافه کرده و خوب مخلوط نمایید سپس لوله را در فریزر به مدت ۱۰ دقیقه تا یک ساعت یا در درجه حرارت اتاق به مدت ۲۰ دقیقه قرار دهید.

۹-لوله را به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ rpmسانتریفوژ کنید.

۱۰-حداقل دوبار دیگر فیکساتیو را عوض کنید تا محلول رویی کاملا شفاف شود.

۱۱- بهتر است که لام ها را روز بعد تهیه کنیم و یا اینکه نیم ساعت در فریزر قرار دهید و سپس لام تهیه نمایید.

۱۲-آخرین مرحله تعویض فیکساتیو را قبل از مرحله لام گیری انجام دهید.

چرا از تثبیت کننده (فیکساتیو) در مرحله برداشت سلول استفاده می شود؟به این دلیل که اثر محلول هیپوتونیک متوقف شود و همینطور برای تثبیت سلول ها در حالت متورم از تثبیت کننده استفاده می کنیم. از آنجاییکه تثبیت کننده از محیط آب جذب می کند و تاثیر منفی بر کیفیت و رنگ آمیزی کروموزوم ها می گذارد بنابراین همیشه باید تازه تهیه شود. این تثبیت کننده همه گلبول های قرمز که در نمونه وجود دارد را لیز می کند.

تذکر: زمان قرار گرفتن درمحلول هایپوتونیک بستگی به شرایط آزمایشگاه دارد. محلول های هایپوتونیک متنوعی در آزمایشگاه ها استفاده می شوند که انتخاب این محلول ها به نوع نمونه و پروتکل آزمایشگاه بستگی دارد و همچنین پروتکل ها بر اساس setup هر آزمایشگاه متفاوت هستند.

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ- پروتکل/کشت نمونه خون محیطی

سیتوژ نتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/هاروست (برداشت)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ پروتکل(مرحله لام گیری)

سیتوژنتیک – تکنیک کاریوتایپ – پروتکل/ رنگ آمیزی نواربندی (G-banding)